如何在早期地球水溶液中选择性形成由α-氨基酸构成的多肽？

生命体中的蛋白质和多肽由α-氨基酸构成，几乎所有的蛋白质和多肽都是由核糖体负责合成。在生命起源的框架下，核糖体不存在，编码/解码体系也没有，那如何选择性的有效产生由α-氨基酸构成的多肽，尤其在地球早期环境下温和的水溶液环境中，是一个一直悬而未决的问题。在米勒-尤里实验中（甲烷+氨气+氢气+电火花），检测到超过30种α-氨基酸（其中包含12种天然氨基酸），3种以上的β-氨基酸，5种烷基胺。在默奇森陨石中，检测到超过70种氨基酸（包含α-、β-和γ-氨基酸）、10种烷基胺，虽然丰度在nmol/g级别甚至更低。而由英国剑桥MRC-LMB的Sutherland课题组提出的氰-硫基化学中，12种天然α-氨基酸以及对应的12种α-胺基腈和一种β-氨基酸可以高效率的产生，同时大量的氨会共存。因此不可避免，如果要在早期地球产生原始多肽，原料肯定是一个包含各类胺（至少包含α-、β-和γ-氨基酸、烷基胺、氨）的混合物。

图1. A) 酸性水溶液中酰胺键的形成。B) 酰胺形成的pH依赖性。C) 竞争性反应条件下α-氨基酸的活性最高。D) α-氨基酸高选择环境下的连续肽键形成。

Sutherland团队之前发现了一种在水中可用的简单活化试剂，甲基异腈（CH₃NC）。甲基异腈能够在水溶液中活化磷酸化合物和羧酸化合物，可分别用于产生RNA和多肽。在本文中，Sutherland课题组对活化羧酸形成多肽的化学选择性进行了深入探索。作者以N-乙酰基丙氨酸（Ac-Ala）为模型肽，在甲基异腈的活化下，分别与不同的胺基亲核试剂在水中进行反应（图1A）。由于甲基异腈作为活化试剂，需要酸催化，在pH高于5的时候，反应非常慢。在pH = 5的时候，各种类型的胺基亲核试剂（α-氨基酸、β-氨基酸、α-胺基腈、α-胺基酰胺、二肽、甲胺、氨）可分别得到对应的酰胺产物，产率从中等到优秀，但是在它们之间的选择性很低（图1B）。当把溶液pH降到4的时候，反应时间从15天缩短到2天。有意思的是，甲胺和氨作为亲核试剂形成酰胺键的活性完全被抑制，二肽和α-胺基酰胺的活性也大幅度降低。但α-氨基酸的活性只是微弱下降，α-氨基腈的活性上升。当继续把pH降到3的时候，反应时间进一步缩短到6个小时，α-氨基酸成为所有被测试胺类化合物中活性最高的亲核物种。此时二肽的活性也被完全抑制，且α-氨基酸形成酰胺产物的产率是β-氨基酸的9倍（图1B）。紧接着，作者进行了一个模拟现实情境的混合竞争实验，将Ac-Ala和各种胺类化合物在pH=3的条件下进行混合反应，只有α-氨基酸和α-氨基腈（α-氨基腈很容易水解成α-氨基酰胺，α-氨基酰胺会进一步水解成α-氨基酸）进行了模型肽的延伸反应，反应产率分别为55 % 和42 %（图1C）。值得一提的是，β-氨基酸的活性在竞争性条件下得到了完全的抑制。作者进一步证明在α-氨基酸高选择性的水性条件下（pH=3），肽链的持续增长仍能有效进行（图1D）。

图2. A) α-氨基酸内在结构依赖的酰胺形成机制。B) 混合酸酐中间体机制的间接证据

作者根据实验结果提出了一种基于α-氨基酸内在结构的反应机制来解释其在低pH下形成酰胺键的高活性。由于α-氨基酸的胺基（共轭酸）的pK_a 在9.2 左右，低pH条件下，胺基会被质子化，从而其亲核活性被抑制。但是α-氨基酸的羧基（共轭酸）的pK_a 在2.1 左右，因此即便在pH = 3的条件下，羧基仍有90 % 处于负离子形式，而可对活化的Ac-Ala进行亲核进攻形成混合酸酐中间体7（图2A）。此中间体对形成酰胺键有两个优势：（1）形成混合酸酐后，胺基的pK_a会降低近两个单位，其质子化程度会随之降低而亲核活性得以一定程度的恢复。（2）产生酰胺键的过程由分子间反应变为分子内反应，使反应的活化熵大大降低。而此反应机制也进一步得到了另一个巧妙实验的佐证。羧基化合物和醇羟基在水中形成酯键是很困难的，因为醇羟基必须与55 M的水溶剂分子竞争。当Ac-Ala和羟基乙酸甲酯11在甲基异腈的活化下进行反应时，没有检测到任何酯类产物的产生（图2B）。而当Ac-Ala和羟基乙酸8反应时，作者顺利检测到80 % 产率的酯产物 9。理论上，β-氨基酸也适用于以上反应机制，但事实是β-氨基酸的活性却远低于α-氨基酸。作者推测，可能是由于相较于α-氨基酸而言，β-氨基酸的胺基和羧基的pK_a都更高，因此有更高程度的质子化而活性被抑制程度更强。且β-氨基酸形成的混合酸酐中间体产生酰胺产物经由分子内六元环过渡态（α-氨基酸经由五元环过渡态），可能都对其低活性有所贡献。

文中的实验结果表明，在地球早期环境下，只要作者描述的试剂和反应条件得到满足，即使在一个充满各种胺类的混合物水溶液中，形成由α-氨基酸构成的随机多肽是可能的。而这些随机产生的多肽可能会具有一定程度的某种催化活性，而以催化的方式反馈到其形成前的诸多化学过程中。但是，还有其他的一些很有意思也很有挑战的问题仍需回答。比如非随机多肽，或者说序列编码的活性多肽如何得以产生。因为如果一个十肽具有催化活性，即便早期的时候只有10种可用的α-氨基酸，完全经由随机聚合产生同样序列的概率极低（1/10¹⁰）。一种可能性是α-氨基酸聚合的时候并不是完全随机，另一种则可能是某种低保真性的编码多肽合成的机制在生命起源之初便存在。但是在更多的实验证据之前，对此不得而知。另一个有意思的问题是，为什么所现代地球生物都使用通用的20种天然α-氨基酸来形成多肽？目前已经知道，非天然氨基酸能够在模拟地球早期环境的实验中产生，且天然陨石中也检测到多种非天然氨基酸。那这个问题的答案是部分隐藏在随机多肽聚合的过程中，还是在蛋白质编码机制的起源中，只有时间和持续不断的探索才能给予我们满意的答案。

Chem. Commun., 2020, DOI: 10.1039/D0CC06042A