提升天然产物产量和活性的“最简单”方法——光照？

众所周知，光照是调节真菌生长、发育、繁殖和次级代谢产物生成的重要因素。近来，美国北卡罗来纳大学格林斯伯勒分校的Nicholas H. Oberlies教授课题组发现，简单的光照即可促进真菌来源苝醌类天然产物hypocrellins和hypomycins的产量和抗癌活性（图1）。对于人皮肤黑色素瘤细胞，hypocrellins在纳摩尔水平上表现出很强的光致细胞毒性（photocytotoxicity）活性，而hypomycins则在微摩尔水平上，有望用于肿瘤的光动力学疗法（photodynamic therapy，PDT）。相关成果发表在J. Nat. Prod. 期刊上。

图1. 光照促进真菌来源苝醌产量和抗癌活性的提高。图片来源：J. Nat. Prod.

苝醌类天然产物hypocrellins（译作“竹红菌素”）具有一个氧化的五环核心和高度共轭的环体系，并表现出多种药理活性。引人关注的是，这类化合物独特的结构使其具有光动力疗法候选药物的潜力。目前，hypocrellins家族主要包括：hypocrellin (1)、hypocrellin A (2)、hypocrellin B (3)、shiraiachrome A (4) 以及本文分离到的ent-shiraiachrome A (5)（图2）。然而，研究这类化合物遇到的第一个难题就是产量低，这是因为该类化合物具有轴手性、阻转异构以及互变异构，使其化学全合成困难重重（如合成化合物2需要19步反应，但总产率仅有1.6%）。因此，通过发酵培养能产生竹红菌素的菌株，调节培养基有效成分、生长条件和环境因子来提高产量或许是一个不错的选择。

图2. hypocrellins家族化合物1-5的结构。图片来源：J. Nat. Prod.

在这些影响因素中，作者尤其对光照作用感兴趣，因为以往的研究表明光照会影响竹红菌素的产生（Photochem. Photobiol., 2019, 95, 812-822），尽管这种影响还存在不确定性。为研究竹红菌素产量和活性的影响因素，他们选择一株生产竹红菌素的真菌（菌株号MSX60519）作为研究对象，分别通过大米、麦片（Cheerios）和燕麦固体培养基进行发酵，并在发酵过程中分别设置三种光照条件（12 h : 12 h光照-黑暗交替、连续LED灯照射、连续黑暗）。待发酵结束后，收集菌株培养提取物，并用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UPLC-HRMS）来确认ent-shiraiachrome A（5）和hypocrellin（1）的生成，同时测定它们的相对丰度。结果表明，在连续黑暗的条件下，菌株产生的化合物1和5丰度最低，而12 h : 12 h光照-黑暗交替和连续LED灯照射都能显著地提高化合物1和5的丰度，这进一步证实光促进了这些化合物的生物合成。在三种培养基中，光照下大米固体培养基发酵产生的化合物1和5丰度最高（图3），其中化合物1的分离量为8-10 mg，而化合物5的分离量则高达~100 mg。

图3. 菌株MSX60519产生的化合物1和5在三种培养基和外在条件下的丰度。图片来源：J. Nat. Prod.

随后，他们对化合物5、1和3进行结构解析。通过高分辨质谱（HRESIMS）、二维核磁图谱（2D NMR）和电子圆二色谱（ECD）分析，得出化合物1（hypocrellin）是化合物2（hypocrellin A）的对映异构体，化合物5是shiraiachrome A (4)的对映异构体，并将其命名为ent-shiraiachrome A（5）。这类化合物因其特殊的结构存在阻转异构（atropisomerization）和烯醇-酮互变异构（tautomerism，图4）。其中化合物1和2在室温下以4:1的阻转异构体混合物形式存在；而化合物5和4则以相对较慢的方式形成阻转异构体平衡混合物。另一方面，包括5在内的hypocrellins化合物在室温下都以1:1的烯醇-酮互变异构体混合物形式存在。有趣的是，化合物3的ECD图谱只有基线，这表明化合物3是以外消旋混合物形式存在的。

图4. hypocrellins的阻转异构和烯醇-酮互变异构。图片来源：J. Nat. Prod.

接下来，他们进一步解析分离到的化合物6、7、8。同样地，通过HRESIMS、2D NMR、ECD、NOESY以及红外圆二色谱解析，分别将3个化合物鉴定为hypomycin A (6)、 hypomycin C (7)、hypomycin E (8)（图5），并确定了它们的绝对构型。有趣的是，对于这些hypomycins来说，最合适的培养基并非此前提到的大米培养基，而是燕麦培养基。

图5. 化合物6、7、8的化学结构。图片来源：J. Nat. Prod.

在此基础上，他们选择人皮肤黑色素瘤癌细胞系（SK-MEL-28）来评估化合物1、3、5和6-8的活性，进行光细胞毒性实验，先用浓度范围为1 nM—300 μM的化合物来处理黑色素瘤细胞，并在黑暗、宽带可见光（100 J/cm²）或单色红光（100 J/cm²，625 nM）的条件下于37 °C（5%CO₂）培养16 h，通过EC₅₀值和光疗指数（PIs）进行评估。结果显示，化合物1、3、5在黑暗状态下细胞毒性较弱（39.3-130 μM），而在可见光及红光照射下，细胞毒性极大提高（可见光10.3-53.5 nM；红光15.3-59.2 nM）。这表明化合物1、3、5很有希望用于肿瘤的光动力学疗法。相比之下，尽管化合物6-8则表现出相对较弱的光敏效应，但在可见光及红光照射下细胞毒性较黑暗状态仍有明显提高。而他们推测这可能是因为化合物6-8相比于1、3、5缺少Δ1(2)位双键，导致彼此光敏活性的差异。

图6. 化合物1、3、5和6-8对SK-MEL-28癌细胞的EC₅₀值和光疗指数（PIs）。图片来源：J. Nat. Prod.

总结

本文研究了真菌固态发酵法生产苝醌类天然产物hypocrellins和hypomycins及其生物活性。不同培养基对产量有显著影响，最有趣的是，这些真菌代谢物的产量和生物活性都可以通过光照来提升。特别是生物活性方面，hypocrellins在可见光及红光照射下的细胞毒性可极大提高，达到纳摩尔水平，是一类很有前途的天然光敏剂，有望用于肿瘤的光动力学疗法。

J. Nat. Prod., 2020, 83, 2490–2500, DOI: 10.1021/acs.jnatprod.0c00492