丝氨酸的首例选择性生物共轭偶联反应

近年来，不同氨基酸残基的专一性生物共轭偶联为多肽及蛋白质的选择性修饰提供了有力手段，简化了非天然或功能性多肽和蛋白的获得，为其进一步药物化学或化学生物学研究奠定了基础。而目前仍未有丝氨酸的选择性生物共轭反应，这是由于不同氨基酸残基种类中侧链装载有多种亲核性基团与羟基的化学选择性竞争与肽链或蛋白质一级结构中多个丝氨酸或苏氨酸残基的区域选择性竞争。自然界中，激酶能够对丝氨酸侧链羟基进行选择性磷酸化，表明基于P(V)的化学反应有望解决这一历史性难题。近日，美国Scripps研究所的Phil S. Baran教授与Philip E. Dawson教授，英国剑桥大学的Gonçalo J. L. Bernardes教授及百时美施贵宝的Eastgate合作，利用Baran等人此前发展的以柠檬烯为骨架的P(V)试剂为基础的PSI或Ψ化学，发展了丝氨酸的选择性硫羰膦酰化反应（Fig.1）。该反应可以直接使用P(V)试剂，避免了P(III)试剂的使用，具有氧化还原经济型且保留了P(V)的高活性，能够一次性在多肽或蛋白中的丝氨酸残基中引入硫羰膦酸酯，为丝氨酸的选择性修饰翻开历史性的一页，通过DFT计算，作者对该反应的化学选择性提出了解释，相关成果发表在J. Am. Chem. Soc.（DOI: 10.1021/jacs.0c05595）。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）  

在以往的研究中，作者等人发现他们发展的P(V)试剂对羟基表现出非常高的选择性，因此，作者通过对该反应条件进行优化，明确了反应条件，随后作者对该反应的通用性进行了初步研究（Fig.2A）。在与不同氨基酸残基，如半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸或硒半胱氨酸的竞争性反应中，即使在高达0.1 M的反应浓度下，丝氨酸均表现出优异的选择性，且反应表现出与已建立方法相当的反应效率。有趣的是，在苏氨酸的存在下，丝氨酸也能以7：1的选择性发生反应。随后，作者对一系列四肽进行了选择性修饰（Fig.2B），反应通常能在15 min内以良好至优异的转化率生成产物。当反应物中包含半胱氨酸时，反应体系内需要加入乙硫醇以避免半胱氨酸巯基与硫代环丙烷生成加成物，且需要使用DTT以还原反应中生成的二硫键。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）   

更复杂的肽也可以发生反应（Fig.3），在有不同亲核性侧链的氨基酸残基中，丝氨酸具有杰出的选择性。由于在药物化学和化学生物学中的独特作用，环肽的改造始终是有机化学家关心的问题。作者利用已发展的方法，以61%的收率首次实现了含不同亲核性残基环肽的衍生化。作者利用该方法对复杂天然产物进行了修饰，能以41%的收率得到含二硫键和酪氨酸的催产素的偶联产物。最后，作者对万古霉素进行了改造，在有一个羧基，一个一级氨基，一个一级酰胺，三个酚羟基，五个二级羟基存在下，反应能够选择性在一级羟基上发生，通过磷氢耦合谱作者对反应结构进行了表征。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）  

作者随后验证了该方法在蛋白质结构改造中的作用（Fig.4）。作者选取了泛素作为模型底物对其进行了结构修饰，在加入P(V)-2b试剂与碱DBU后，反应生成了单一标记的蛋白，通过用胰蛋白酶消化与LC-MS/MS质谱分析，作者确定硫羰膦酰化发生在丝氨酸残基上，在此基础上，作者使用P(V)-1，P(V)-3，P(V)-4对泛素进行了修饰。此外，该方法也能够对DNA结合蛋白阻遏蛋白进行修饰，以35%的转化率生成产物。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.） 

最后，作者通过DFT计算对反应的机理和选择性进行了探索（Fig.5）。结果表明，该反应的能垒限制在五配位双三角锥中间体的生成（TS1）和坍解（TS2）。该反应其他步骤还包括热力学有利的中间体环构象反转（TS3）和膦酰化氨基酸的S_N2反应与同时释放环己烷硫离子（TS4），TS3是环构象翻转的过渡态结构，有着最高的能垒。在双三角锥中间体TS1的形成过程中，丝氨酸与苏氨酸有着类似的能垒差，但丝氨酸能垒略低于苏氨酸，与实验结果一致；而赖氨酸和酪氨酸形成TS1的能量远高于丝氨酸，体现了反应化学选择性的根源。TS2标志着双三角锥中间体的坍解，包含P-S键的解离和可能发生的环伪旋转过程，该过程将还原P(V)产物中O-P-O键的键角及四面体构型。对含羟基的氨基酸，TS2要比TS1能量低8 kcal/mol，而对于半胱氨酸而言，双三角锥中间体的坍解能量高于其生成能量，因此该过程倾向于反应物的生成。经过对TS2-Ser和TS2-Cys的能量比较，作者发现TS2-Cys不倾向于发生环构象反转。值得一提的是，作者认为，酪氨酸和半胱氨酸的低反应活性从某种程度上来说可以简单归结为其逆过程更易发生。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）  

总结：  

美国Scripps研究所的Phil S. Baran教授与同单位的Philip E. Dawson教授，英国剑桥大学的Gonçalo J. L. Bernardes教授及百时美施贵宝的Eastgate合作，发展了基于P(V)试剂的丝氨酸选择性生物共轭偶联反应，首次实现了丝氨酸的选择性修饰，制备了包含环肽、天然寡肽和蛋白在内的一系列硫羰膦酸化蛋白，为制备含丝氨酸的非天然多肽和蛋白提供了有力工具，将极大地促进药物化学和化学生物学的相关研究。通过DFT计算，作者对反应的化学选择性进行了合理解释，提出反应过程中不同氨基酸在双三角锥中间体的形成和坍解中的能量高低决定了反应专一地在丝氨酸侧链羟基进行，对氨基酸的选择性修饰新方法的开发具有一定的指导作用。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c05595