对环境敏感的变色荧光团用于生物成像

chem化学科普2020-09-253.0W+

对环境敏感的变色荧光团用于生物成像第1张

荧光探针的适用性决定了通过荧光成像方式研究活细胞中生物学过程的可行性。其中，罗丹明是一种非常明亮且稳定的荧光团，主要以非荧光的螺环形式和有荧光的两性离子形式存在（Figure 1a）。罗丹明的不带电螺环形式使得其具有良好的细胞渗透性，而其与生物靶标结合导致平衡从非荧光形式转变为荧光形式，大大增加了探针的信噪比。此外，最新研究发现，与蛋白结合后的罗丹明，其两种形式的平衡取决于蛋白质的构象，这为以罗丹明为基础构建新型蛋白质生物传感器奠定基础。

近日，德国马克斯·普朗克医学研究所的Kai Johnsson和Lu Wang基于可通过螺环化作用可逆地在绿色和红色荧光之间切换的变色荧光团（CSFs），开发了一种比率荧光探针及一种可在活细胞中进行钙离子（Ca²⁺）成像的比率生物传感器，用于蛋白质的检测和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的定量测定。相关成果以“Environmentally Sensitive Color-Shifting Fluorophores for Bioimaging”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202008357）。

作者以香豆素和苯并吡啶组成的杂化荧光团（1）为基础设计荧光探针，并用缺电子的酰胺（酰基氰胺（2）、酰基磺酰胺（3）和酰基磺胺（4））取代（1）中的羧基，将平衡推向绿色螺环态（Figure 1b），这些酰胺已被证明可以促进罗丹明的可逆螺环化。为了评估化合物1-4的两性离子形式和螺环形式之间的平衡，作者测量了化合物的D₅₀值（与在二恶烷-水滴定中测得的最高吸光度相比荧光两性离子的吸光度减少一半的介电常数），结果表明引入酰基氰胺（2），酰基磺酰胺（3）和酰基磺胺（4）可以显著提高D₅₀值（Figure 1c）。

为了探究CSFs对蛋白质的环境敏感性，作者用广泛使用的自标记蛋白质标签HaloTag7作为模型。其中，探针5-8是通过氯烷烃HaloTag7底物[2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙-1-胺]与化合物1-4偶联而成（Figure 1d），探针5为对照化合物，探针6-8被期望是CSF探针。在与HaloTag7偶联之前，探针6-8主要以螺内酰胺形式存在，显示出绿色荧光信号，且具有和香豆素荧光团相似的消光系数和量子产率（Figure 1g）。与HaloTag7偶联后，探针6-8的荧光从绿色变为红色，表明其从封闭形式到开环形式的转变。令人惊喜的是，带有N,N-二甲基磺酰胺的探针8在HaloTag7标记后表现出最大的颜色变化（Figure 1e and 1f），其吸光度和荧光的变化分别高达648倍和2392倍。

对环境敏感的变色荧光团用于生物成像第2张

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

近年来，研究者们将Ca²⁺结合域插入HaloTag7结构形成嵌合体，其中Ca²⁺的结合影响着与HaloTag连接的罗丹明的平衡向螺环化形式转变，从而产生荧光的变化。因此，作者猜测CFS可以代替单通道荧光团用来设计比率型Ca²⁺传感器（Figure 2a）。作者基于HaloTag7设计了37种不同的传感器，经筛选发现在HaloTag7的残基Gln 150和Ala 151之间插入CaM/M13结构域可以产生最明显的比率荧光变化（Figure 2b），通过Ca²⁺滴定表明其具有14.1倍的荧光变化，Ca²⁺的c₅₀值为363±14 nM（Figure 2c）。

随后，作者在活细胞中验证了探针的Ca²⁺成像能力。作者用离子霉素处理增加细胞的钙浓度，惊喜地发现随着时间的推移，绿色荧光略有增强，而红色荧光显著减弱，荧光比率的变化为3.9倍（Figure 2d and 2e）。以上结果证实了基于CSF的探针在构建生物传感器方面的潜力。

对环境敏感的变色荧光团用于生物成像第3张

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

除此之外，作者猜测基于CSF的探针与其他蛋白质的结合也可以改变螺环化的平衡。因此，作者将CSF 2-4偶联到SNAP-tag、细菌二轻叶酸还原酶（eDHFR）、人类碳酸酐酶Ⅱ（HCAⅡ）和人墨蝶呤还原酶（hSPR）四种蛋白质靶标的配体上（Figure 3a）。在所有蛋白质中，CSF 9-12的结合使平衡从绿色转为红色（Figure 3b-3f）。其中，探针9表现出最明显的变化，与eDHFR结合后显示出2340倍的荧光强度变化（Figure 3b and 3g）。基于此，作者创建了一种针对NADPH的生物测定法，探针荧光的变化严格取决于NADPH的存在（Figure 3h）。作者测得探针9在用NADPH滴定eDHFR突变体的条件下具有486倍的荧光比率变化，NADPH的c₅₀值为140±21 nM（Figure 3i and 3j）。这种简单且灵敏度极高的测定法为生物样品NADPH的定量分析提供一定的依据。