衰老是影响大多数生物的时间依赖性生理功能衰退现象，也是许多非传染性疾病最严重的风险因素。人类衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是目前应用最广泛的衰老生物标志物，是评估细胞健康衰老程度和预测个体健康寿命的重要工具。SA-β-gal是GLB1表达的一种内源性溶酶体酶，其催化结构域与其他种属来源的β-半乳糖苷酶（β-gal）有很大不同，而其他种属来源的β-gal，如细菌β-gal，通常是与衰老无关的。因此，开发针对这种酶的种属选择性化学探针对衰老的准确识别具有重要意义。
近日，华东理工大学李剑教授和西北大学郭媛教授合作，利用不同种属β-gal的酶结合底物口袋形状不同，设计并开发出了第一代可区分识别人类SA-β-gal与细菌β-gal的荧光探针分子，首次实现了SA-β-gal的种属选择性可视化识别。相关成果以“First-generation species-selective chemical probes for fluorescence imaging of human senescence-associated β-galactosidase”为题发表在Chemical Science上（DOI: 10.1039/D0SC01234C）。
图1 E. coli β-gal E537Q与KSL01的复合物晶体结构
（图片来源：Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/D0SC01234C）
作者首先基于HBT骨架开发了基础荧光探针KSL01，构建了来自大肠杆菌（E.coli）β-gal“TIM”催化结构域的突变体E537Q，并成功获得了KSL01与E537Q的复合物晶体（图1）。作者通过解析该复合物的三维晶体结构，发现KSL01中引入的self-immolative对甲酚连接子将探针分子中较大基团部分延伸到酶结合口袋之外，降低了位阻，使探针结合成为可能。进一步通过比较human β-gal, A. oryzae β-gal和E.coli β-gal的结构，作者发现E.coli β-gal酶口袋形状与 human β-gal和A. oryzae β-gal的不同，并且human β-gal和A. oryzae β-gal同属于GH35家族，提出A. oryzae β-gal更适合作为human β-gal的体外模型，并在此基础上进行种属选择性β-gal化学探针的设计和开发。
图2 结构导向的β-gal荧光探针设计
（图片来源：Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/D0SC01234C）
随后，作者基于KSL01，通过调节识别基团（β-半乳糖苷单元）周围位阻，设计、合成了12种β-gal化学探针KSL01-KSL12以适应不同种属β-gal的酶口袋形状（图2）。有趣的是，这12种探针均可灵敏识别A. oryzae β-gal并可在各自的光学区域观察到荧光开启信号，为这种酶的检测提供了green-to-NIR的广泛颜色选择。更重要的是，KSL08-KSL12作为第一代种属选择性荧光探针被筛选出来，因为他们只选择性识别A. oryzae β-gal，而对E.coli β-gal不响应。
图3 KSL04与KSL11对生物样本中不同种属β-gal的荧光成像
（图片来源：Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/D0SC01234C）
生物成像结果证实，与非种属选择性探针KSL04相比，种属选择性探针KSL11可不受细菌β-gal的干扰，实现对生物样本中SA-β-gal的特异性成像（图3）。此外，作者利用所开发的探针还发现，随着自然衰老，小鼠体内SA-β-gal逐渐累积，并且在肺、心、肌、脑、脾、肝、肾等主要器官中，肾脏中SA-β-gal积累最多，表明肾脏是衰老过程中最严重的器官（图4）。
图4 KSL04和KSL11对自然衰老小鼠器官和复制性衰老MRC5细胞中SA-β-gal的荧光成像
（图片来源：Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/D0SC01234C）
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