基于二硒化物的“turn-on”型荧光探针用于硫氧还蛋白还原酶的检测

硫氧还蛋白还原酶（TrxR）是一类存在于哺乳动物体内的硒蛋白，主要以在胞质中的TrxR1、在线粒体中的TrxR2和在睾丸中表达的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）三种形式存在。胞质中的TrxR系统由TrxR1、硫氧还蛋白（Trx）和NADPH组成。其中，TrxR1在黑色素瘤、肺癌和前列腺癌等许多癌症中过表达。因此，研究选择性检测TrxR1的方法具有重要的意义。  

近日，美国波特兰州立大学的Robert M. Strongin和俄勒冈健康与科学大学的Pamela B. Cassidy合作，通过将半萘罗丹明类染料与链状二硒化物淬灭剂偶联，合成了第一个基于二硒化物的荧光探针1a，用于选择性检测TrxR的活性。其中，TrxR还原二硒键，使探针的荧光开启。相关成果以“A Diselenide turn-on Fluorescent Probe for the Detection of Thioredoxin Reductase”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202004094）。  

首先，作者使用AutoDock Vina和UCSF Chimera的对接探究了不同构型探针的结合能以及从探针到Sec（U498）残基的距离（Figure 1）。结果表明，与含有二硫键的探针1b相比，TrxR对1a的亲和力更高。 

 二硒键探针1a的选择不仅实现了TrxR1选择性，还优化了动力学，其主要的响应机制如Scheme 1所示。作者猜测，由于硒醇的pKa比硫醇低以及硒化物的亲电性比二硫化物大，硒醇比硫醇盐更容易形成。这主要是因为硒的原子半径较大，空间拥挤度较小，二硒化物σ*反键轨道的能量相对较低，具有更小的键能，有利于键的断裂。 

随后，作者简单介绍了探针1a和1b的合成过程（Scheme 2）。1,8-二羟基萘（8）经CH₃I单烷基化得到化合物7。罗丹明110盐酸盐（4）经水解形成化合物3，并与化合物7经霍本-赫施反应得到荧光染料2。随后荧光染料2与羟基二硒化物5在三光气的作用下得到探针1a。同样的，作者用类似的方法制备了二硫化物探针1b。 

为了探究探针的光学响应性，作者在含有EDTA、BSA和NADPH的磷酸盐缓冲液中，用大鼠肝脏中的TrxR1进行了酶促分析，结果表明荧光染料2的荧光强度与TrxR1的浓度成正比。对于0.12单位的酶（约100 nM的TrxR1），反应在30分钟内达到稳定，且反应需要NADPH的存在（Figure 2）。 
 

随后，作者进行了不同浓度的探针1a（0-20 μM）在TrxR1（0.12单位）存在条件下的动力学研究，并绘制了反应速度与底物浓度的关系图，计算得到K_m值约为15.89 μM（Figure 3），这表明TrxR1与探针1a之间具有较高的亲和力。 

  为了探究探针1a的选择性，作者选择常见的生物还原剂（Na₂S、Hcy、Cys、GSH等）与探针1a进行反应，发现只有TrxR1显示出明显的荧光增强（Figure 4）。而相比之下，GSH对探针的干扰性相对较大，但实验是在GSH为毫摩尔（生理细胞）水平下，但TrxR1（100 nM）远低于生理条件下进行的。 

为了实现细胞成像，作者将HCC827（肺腺癌）细胞接种到96孔板中并培养过夜，24小时后用TrxR的不可逆亲电子抑制剂2,4-二硝基氯苯（DNCB）处理细胞1小时，最后用探针1a和1b孵育，并进行荧光共聚焦成像。荧光成像图显示只有在仅用探针1a和1b处理的细胞中表现出强烈的荧光，DNCB的处理使细胞的荧光明显减弱（Figure 5）。 

总而言之，作者设计并合成了探针1a，实现了对TrxR1的选择性检测和成像，对确定细胞氧化还原状态具有重要意义，为检测TrxR过表达的黑色素瘤提供了潜在的工具。