螺环骨架化合物在新药开发中的应用

图4. 达卡他韦、先导化合物1和雷迪帕的结构和生物活性

雷迪帕韦不仅具有高的复制子抑制活性，还展现了良好的生物利用度和较长的半衰期（鼠、狗、猴体内4.7-10.3小时），以及较低的预测人体清除率（0.012 L/h/kg）（如图5）。在对大鼠和狗进行的14天毒理学研究中，没有发现雷迪帕韦产生明显的不良结果。

  图5. 雷迪帕韦动物模型研究

2014年10月10日，FDA批准了名为哈维尼（Harvoni）的复方产品（雷迪帕韦/索非布韦固定剂量组合片剂）用于1、4、6型丙肝的治疗，治愈率高达99%，副作用也比其他丙肝治疗药物小很多。组合中，雷迪帕韦的作用是抑制重要的HCV病毒NS5A蛋白；而索非布韦被代谢成三磷酸尿苷模拟物，通过NS5B聚合酶掺入RNA，作为RNA链终止子。

▼螺环结构提高抑制选择性和生物利用度

糖尿病（Diabetes）是一种因遗传因素、环境因素等多种原因引起的以高血糖为特征的全身性代谢性疾病。据国际糖尿病联盟（IDF）的最新统计，全球糖尿病在20-79岁成年人中的患病率为8.3%，其中80%在中等和低收入国家。传统降糖药物的作用机制包括补充胰岛素、促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗、促进葡萄糖利用等；随着科学家们对糖尿病生理病理学的深入研究，发现肾脏近曲小管中的钠-葡萄糖转运蛋白（Sodium-glucose linked transporters, SGLTs）对维持血糖稳定起着关键作用。血糖主要是通过SGLT1和SGLT2重吸收，然后由SGLTs受体转运进入血液。SGLT1是一种高亲和力、低容量的钠-葡萄糖/半乳糖转运蛋白，负责约10%的葡萄糖重吸收，同时负责对饮食葡萄糖的正常吸收。特异性抑制SGLT1可以减少葡萄糖吸收，但会伴有胃肠道不良反应甚至是致命的腹泻。SGLT2是一种低亲和力、高容量的钠-葡萄糖转运蛋白，负责约90%的葡萄糖重吸收，特异性抑制SGLT2可以有效阻断近端小管对葡萄糖的重吸收并经尿排出多余的葡萄糖。正因为大部分从肾小球滤过的葡萄糖主要通过SGLT2重吸收，因此SGLT2选择性抑制剂成为降糖药物研究的热门靶点。

根皮苷（Phlorizin）是1853年从苹果树根皮中提取的葡萄糖基二氢查尔酮类化合物，生物活性测试表现出提高胰岛素敏感性、降低血糖的作用，是第一种被发现SGLT竞争性抑制剂。然而根皮苷在体内易被糖基水解酶水解，生物利用度低，以及同时抑制SGLT1导致肠道葡萄糖和半乳糖吸收不良等原因，没有被进一步开发。日本中外制药公司将Phlorzin进行结构改造，制备得到氧杂螺环[4. 5]癸烷化合物托格列净（Togoflozin），其SGLT2抑制活性达到2.9 nM；SGLT2/SGLT1选择性高达近3000倍，较阿斯利康的达格列净（Dapagliflozin）高了5倍（如图6）。

图6. 托格列净、达格列净、根皮苷结构式和活性数据

接着，药物化学家考察了苯环上的取代基对于抑制活性和选择性的影响，发现R1被烷基取代、R2未取代的几个候选化合物的选择性都高达3000，进一步考察其口服生物利用度，发现Tofogliflozin在正常ICR小鼠中到达75%，猕猴模型中高达85%，较其他候选化合物都优秀很多（如图7）。

图7. 苯环取代基对于活性的影响    

因此，2015年日本厚生劳动省批准了Topagliflozin上市，其在降低血糖的同时还能减轻体重，亦不存在明显副作用；显示出的良好潜力或许能为糖尿病患者带来福音，但仍需更大规模样本的研究来进一步明确其疗效与风险。与此同时，美国、欧盟等地也审批通过了达格列净、卡格列净、艾帕列净等SGLT2选择性抑制剂上市，为广大糖尿病患者带来了更多的选择。

▼螺环全新结构提高半衰期、突破原研专利

肿瘤患者化疗导致的恶心呕吐（CINV）是常见的不良反应，甚至导致患者代谢紊乱、营养不良，影响其生活质量和治疗依从性。神经激肽家族包括NK-A，NK-B和P物质，其受体分为三种亚型NK-1，NK-2和NK-3。进一步研究发现NK-1受体在脑组织中高度表达，神经激肽-1受体拮抗剂可以通过与大脑中的NK-1受体高选择性的结合，拮抗P物质来发挥功效；对化疗引起的恶心和呕吐，尤其是对急性、延迟性呕吐具有良好的控制效果，此外还具有很好的抗抑郁、抗焦虑作用。美国默克公司的阿瑞匹坦（Aprepitant）是第一个上市的NK-1受体拮抗剂（如图8）

图8. 阿瑞匹坦和Rolapitant的结构式和活性数据       

另一家美国公司先灵葆雅发现了氮杂螺环[4. 5]癸烷化合物Rolapitant展现了高效的NK-1选择性，其与NK-2和NK-3受体选择性大于1000倍；其NK-1抑制Ki值为0.66 nM（如图8和9）。[7]与其他具有CINV治疗作用的NK-1抑制剂相比，Rolapitant对CYP3A4无抑制作用，消除了与CYP3A4底物协同使用时的顾虑。此外，Rolapitant是一种半衰期相对较长（7.5天）口服活性药物，为基于单一和化疗前的治疗提供了潜在的机会。

         图9. Rolapitant的NK受体抑制活性

在三个涉及接受中度致吐化疗（MEC）和高度致吐化疗（HEC）的大型临床试验中，受试者使用Rolapitant与格拉司琼（Granisetron）和地塞米松（Dexamethasone）联合治疗，与仅接受格拉司琼和地塞米松治疗的受试者相比，受试者的完全缓解有显著改善。2015年9月，美国FDA批准了Rolapitant的上市申请，联合使用其他止吐剂用于预防与致吐性肿瘤化疗初次或多次治疗相关的迟发性恶心及呕吐。

▼螺环结构改善药代动力学性质，提高成药性

随着社会经济的发展和生活水平的提高，肥胖正在全世界范围内迅速流行，成为令人担忧的全球性健康问题。产生肥胖的生理病理机制主要是能量代谢不平衡，摄入热量大于人体消耗热量；脂肪合成增加是肥胖症（Obesity）的物质基础。近些年来，科学家们对抗肥胖症的生物靶点进行了系统性研究，包括中枢系统调控的饱腹和饥饿调节系统等等；其中，黑色素聚集激素（Melanin concentrating hormone, MCH）及其受体引起了研究者的广泛兴趣。在哺乳动物中，MCH主要在下丘脑的侧部和未定带的神经细胞中表达生成，其生物活性是通过位于中枢神经系统的G蛋白偶联受体来调节。科学家已发现两个MCH受体亚型，分别是黑色素聚集激素受体1（MCHr1）和黑色素聚集激素受体2（MCHr2）。其中，MCHR1参与到对食物摄入的神经元调节之中，并对饮食和能量平衡具有调控作用；而MCH主要是通过与受体MCHr1的结合而发挥作用。因此，MCHr1拮抗剂在治疗肥胖疾病方面具有积极作用和美好的前景；同时具有一定的抗焦虑和抗抑郁的作用。

美国百时美施贵宝的药物化学家通过高通量筛选的方法发现了苗头化合物2。[8]深入研究发现，化合物2含有两个苯环和一个碱性的氨原子，一共三个hERG药效基团，hERG通道的IC50值达到5.5 μM。虽然在麻醉的豚鼠体内没有发现急性心血管病症，但是减少hERG通道作用被认为是该苗头化合物需要改善一个参数。之后经过构效研究发现，将吡咯环片段改造成螺环[3.3]庚烷的化合物AZD1979，其抑制活性达到纳摩尔级别（Ki MCHr1 (GTRgS)= 5.2 nM; Ki MCHr1 (Bonding)= 12.2 nM）；hERG通道的IC50值减少到22 μM（如图10）。

图10. 苗头化合物2和AZD1979的结构式和活性数据

进一步研究发现AZD1979具有良好的药物代谢和药代动力学特性，在DIO小鼠模型（Diet-induced obese mice）中口服给药后，对体重减轻有显著效果（如图11）。2014年，这一MCHr1拮抗剂AZD1979开展了临床I期的安全性研究，未来有可能作为治疗肥胖、抑郁和焦虑症的一款治疗药物。

图11. AZD1979的药代动力学数据

▼螺环结构提高hERG通道选择性，增加成药性

蛋白质中酪氨酸残基的磷酸化与去磷酸化是调控细胞信号转导通路的关键。酪氨酸磷酸化是由蛋白酪氨酸激酶（PTKs）和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）协同作用，对于大部分细胞过程的信号调控至关重要。PTKs和PTPs平衡的紊乱会导致酪氨酸磷酸化作用发生异常，从而会引起包括肿瘤在内的多种人类疾病。SHP2属于蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）家族成员之一，具有许多重要的生物学功能，参与多种致癌细胞信号级联；SHP2在程序性细胞死亡通路（PD-1/PD-L1）中发挥重要作用，参与免疫检查点通路调节，有助于免疫逃逸。SHP2的重要性在一个大型的基因敲除实验中被发现。诺华的研究人员以390个人类癌症细胞系为对象，逐一敲除了7500个基因（几乎是三分之一的人类基因组），来观察细胞出现的问题。该研究小组发现了一个惊人的模式：在一个或多个酪氨酸激酶受体有改变的细胞中，SHP2的降低让癌细胞几乎“残废”，也就是说癌细胞的生存依赖于SHP2。

诺华制药公司的科学家发现了两个新的具有SHP2抑制活性的变构结合位点，同时通过高通量筛选的方法获得了3个具有潜力，选择性的口服抑制剂。通过这3个抑制剂与SHP2变构口袋的共晶结构解析（如图12），药物化学家设计合成了吡唑并嘧啶酮类化合物3，其SHP2生物化学抑制活性达到0.067 μM；SHP2调节的ERK激酶磷酸化抑制活性达到0.746 μM。[9]化合物3与SPH2变构结合口袋的共晶结构分析，证实结构中涉及的药效团模型参与所有的蛋白与配体的相互作用。进一步药代动力学试验显示，化合物3具有可接受的PK性质，其老鼠的口服利用度达到25%，清除率为34 mL/min/kg；hERG通道抑制活性IC50值是0.200 μM。

          图12. 苗头化合物3和SPH2的共晶结构

由于吡唑并嘧啶酮类化合物3具有一定的成药性，在此结构基础上，药物化学家对于4-氨基哌啶环进行结构改造，设计合成了一系列螺环[4.5]癸烷，发现了先导化合物SHP389，其SHP2生物化学抑制活性达到0.036 μM；SHP2调节的ERK激酶磷酸化抑制活性提高到0.036 μM；抗增殖活性从4.76 μM提高到0.36 μM，hERG通道抑制活性IC50值是17.0 μM（如图13）。

图13苗头化合物3和先导化合物SHP389的结构式和活性数据      

在细胞水平上，螺环结构SHP389成功地平衡了生物化学抑制活性和hERG选择性。然而SHP389最终未能证明其具有足够优秀的口服生物利用度，来支持药代动力学和药效动力学实验以及肿瘤疗效研究。综上所述，药物化学家发现5,6-稠环和螺环[4.5]癸烷的结构是有效提高hERG通道选择性的结构筛选策略，可以作为进一步结构优化的基础。

与此同时，诺华公司另一个团队结合两个苗头的化合物药效基团，设计了氨基嘧啶酮类化合物4，其具有与苗头化合物相似的抑制活性（IC50 = 0.105 μM）；降低的亲脂性（clog P= 1.9）和提高的亲脂性效率（LipE= 5.1），使其体内的药物性质改善很多。[10]接着，他们在结构中两个芳环结构中间引入硫原子，形成硫醚化合物5，在生化和细胞分析中发现，其抑制活性更高（IC50 = 0.012 μM）；细胞能力提高很多，SHP2调节的ERK激酶磷酸化抑制活性达到0.049 μM；抗增殖活性达到0.273 μM，hERG通道抑制活性IC50值是6 μM（如图14）。这些优良的结果提示药物化学家们，嘧啶酮核心骨架=可以作为未来结构优化的基本骨架。

图14. 苗头化合物4, 5和先导化合物SHP394的结构式和活性数据

接着，诺华的药物化学家们以氨基嘧啶酮作为核心骨架，对于芳基片段和氨基片段进行筛选，发现芳基片段为2-三氟甲基吡啶，氨基片段为氮杂螺环[4.5]癸烷结构化合物SHP394，其SHP2生物化学抑制活性达到0.023 μM；SHP2调节的ERK激酶磷酸化抑制活性提高到0.018 μM；抗增殖活性达到0.297 μM，hERG通道抑制活性IC50值超过30 μM（如图15）。其在小鼠和老鼠的肝微粒体中，显示了低的清除率（Clint = 7.9−11.1 μL/min/mg; T1/2 > 2 h）；在鼠的药代动力学研究展现了低的清除率（Clint = 21 μL/min/mg; T1/2 > 10.9 h）和中等的口服暴露与口服利用度。因此，氨基嘧啶酮类化合物SHP394及其类似物作为可选的先导化合物，是一类潜在的、选择性的、口服抑制剂，为今后研究SHP2在信号转导和人类疾病中的多方面作用提供了有效信息。

 图15. 氨基嘧啶酮骨架结构的构效关系研究

虽然到目前为止开发最广泛的螺环支架大都涉及的是5元环和6元环，但药物化学家认为在未来将看到更多的螺环系列被开发，包括更多的4元环和7元环。即使在spiro[3.3]环系中，其多样性也比通常认为的要大得多。要充分发挥螺旋环的潜力，还必须有能力控制螺旋环上的多个立体中心。因为在一个商业药物发现的环境中，涉及多个立体中心的化学研究可能是非常有挑战的。各种稳健的合成方法在学术界的发展，以及合成砌块的商业可用性，将加速立体化学复杂螺环在药物发现中的应用。