你是我的眼：NMR在结构确证中的应用策略

核磁共振（NMR）在当今有机化合物结构解析中占有举足轻重的地位。大到复杂天然产物的结构鉴定，小到有机合成产物的结构表征，NMR的身影无处不在。毫不 夸张地说，NMR就是有机合成人的眼睛。NMR技术博大精深，每个人掌握的水平也是良莠不齐，可能很多同学对NMR的应用还停留在看看化学位移，数数积分 数值的层面上。以ChemDraw结果为标准研判NMR的同学请自行面壁。今天，借用魁北克大学Steven R. LaPlante课题组在Bioorg. Med. Chem. Lett.发表的文章帮大伙擦亮双眼，分享一下各种NMR技术在有机化合物结构解析中的应用策略。

作者开篇先举了两个药物研发领域中结构表征错误的例子。2012年，C&EN警告消费者博舒替尼（Bosutinib，1b）的错误异构体1a被在市面上出售，而该异构体是没有活性的。C&EN原文指出这两个化合物的质谱和元素分析是完全一样的，虽然两个化合物氢谱的芳环信号有所差异，但是如果不将这两个化合物对比分析很难发现问题。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

另一个例子则是关于诱导肿瘤细胞凋亡的化合物TIC10。这个化合物于1973年和2013年被两个不同的公司申请了专利。随后当Scripps研究所人员在研究这个化合物时发现他们制备的化合物居然没有活性。经过仔细分析后发现，被两个公司先后申请专利的化合物2a没有活性，有活性的化合物是其异构体2b。这个例子也真够对得起BMCL作者给的这个化合物编号，虽然原文作者不是中国人。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

咱们接下来就按照原文作者的思路学习一下什么情况下该用什么NMR实验鉴定结构。

区域异构（Regioisomerism）

有的反应由于不可控性会使得一些官能团以非常规形式连接到另一分子上从而产生区域异构体。这种情况下利用常规的LC-MS和¹H NMR是很难进行有效区分的。这时应用HMQC（HSQC）和HMBC两种2D-NMR实验通常可以轻而易举地解决这种问题。如下图所示，作者随手给了一个应用HMBC鉴定区域异构体的例子。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

当然，作者也提到了HMBC实验本身的一些不足，比如会有¹J_H,C和⁴J_H,C信号的干扰，这有时会影响一些化合物的解析。分享一个我个人的经验吧：¹J_H,C信号结合HSQC谱很容易分辨，所以也有人管这个信号叫QC残留信号。对于⁴J_H,C信号，当用核磁软件读取原始HMBC数据图时可以通过调整切面高度，比较信号强度等手段排除⁴J_H,C信号的干扰。

另外，作者认为2D-NMR实验中的ROESY实验在判别区域异构体时也可以作为重要的依据，它可以提供分子内空间距离在5埃之内的氢原子信息。如下图所示，作者又举了一个例子。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

同样，作者也提到了ROESY实验的一些缺点，主要是会有一些假信号的干扰。说到这，再跟大伙分享一个自己的实战经验吧：ROESY实验确实方便，一下子能获得分子所有氢原子之间的空间关系。ROESY谱中有相关信号的两个氢原子位置相近这毋庸置疑，但是ROESY谱中没有相关信号的两个氢原子不一定空间距离远。对于这种有疑问的氢原子需要做1D-NOE差谱来最终给出结论。

几何异构（Geometric Isomerism）

几何异构体（E/Z）常见于各种含双键化合物当中。通常，大家可以通过双键上两个氢原子的耦合常数进行判断，cis构型的耦合常数大约在3-13 Hz，trans构型的耦合常数大约在12-20 Hz。基础知识稍微扎实点的同学都是知道这些考点的。可是，当双键上的氢原子和其他原子存在耦合时，图谱变得复杂，耦合常数很难准确读出。作者提示咱们，可以尝试选择性去耦氢谱读出耦合常数，具体的例子见下图，蓝色图谱是选择性去耦之后的氢谱。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

看完作者举的图，我想到一个简单粗暴方法，换机器呗（混过网吧的同学肯定懂的），400 MHz测的不行就换600 MHz，要不换800 MHz，还有1G的呢，备不住过两年听着更像U盘了，2G、4G、8G，神马都有。

旋转异构/阻转异构（Rotamers/Atropisomers）

在某些分子中，一些特殊因素可以限制单键的自由旋转或者环的自由翻转，这就产生了旋转异构体或阻转异构体。遇到这种情况，作者提供了常见的解决办法：换溶剂、变温度以及ROESY。作者以三级酰胺的NMR变温实验和ROESY实验为例介绍了这种旋转异构体的NMR信号特点。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

N-烷基化和O-烷基化（N- vs. O-Alkylation）

当分子中的氮原子和氧原子都可被烷基化时，我们需要对产物的烷基化位点进行分辨。除去之前提到的ROSEY、HBMC或HSQC实验可以用于解析烷基化位点以外，碳谱中的化学位移值也可以很容易地鉴定出产物的烷基化位置。这个简单也常见，咱就不多说了。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

立体化学异构体（Stereoisomerism）

确定手性分子的绝对构型一直以来都是富有挑战性的。作者也承认X射线单晶衍射技术无疑是最合适的手段，但是ROESY实验在很大程度上能够给出化合物的相对立体构型。作者以化合物9为例，利用ROESY谱相关信号的强弱解析了该化合物的相对立体构型。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

文末，作者总结了一个超级实用的表格告诉大家什么情况应该用哪种NMR技术。

图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

绝对的实用干货，适用于大多数有机合成初学者，同学们可以多多转发，拯救更多被NMR困扰的小伙伴们。我们更欢迎各位整日以鉴定结构为业的植化/天然药化大牛们也来分享自己的宝贵经验。

最后，本人安利两本书吧，绝对是学习结构解析的经典教材。英语阅读无障碍，喜欢原汁原味的同学请看原著；能够接受翻译版本的同学就看药明康德分析部译的这个中文版吧。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960894X16312197

NMR Strategies to Support Medicinal Chemistry Workflows for Primary Structure Determination

Bioorg. Med. Chem. Lett., 2016, DOI: 10.1016/j.bmcl.2016.11.066

标签： NMR