助力抗新冠药物研发

自2019年12月以来，新型冠状病毒席卷全球，绵延至今已造成多达400万人感染和超过30万患者的死亡。更为遗憾的是，针对该疾病尚无临床特效的药物用以治疗。冠状病毒的主蛋白酶（3C样蛋白酶）对于冠状病毒的生命活动极为重要，是抗冠状病毒药物设计的重要靶点。现阶段针对该类蛋白酶的研究主要集中于其底物的特异性研究和二聚化的研究，然而对其催化机制缺乏系统性地研究，制约了其相应抑制剂的发展。因此，亟待洞悉冠状病毒主蛋白酶的催化机制，更好地设计和发现抑制剂。

近日，南开大学药学院尚鲁庆副教授团队在美国化学会期刊ACS Catalysis 上在线发表研究性论文，报道了冠状病毒主蛋白酶催化机制研究，讨论了MERS-CoV与SARS-CoV主蛋白酶在催化过程中的区别，积极拓展催化机制的有效应用。药学院博士研究生王昊为该文章的第一作者，药学院林建平团队的李冬梅副教授是另一位共同通讯作者。

为了对冠状病毒主蛋白酶的催化机制进行系统性的研究，该团队获得冠状病毒主蛋白的晶体结构，构建酶活分析体系和确定蛋白酶的催化活性中心。随后开始相应的主体研究。

冠状病毒主蛋白酶的催化机制研究

该团队将MERS-CoV与SARS-CoV主蛋白酶的催化过程分为两个阶段进行研究：底物结合阶段（即识别阶段）和催化阶段（即酶切阶段）。以MERS-CoV的主蛋白酶为例，在底物结合阶段，该研究证明蛋白酶的S1口袋一方面利用保守性E169-H175的体积效应识别底物P1位Gln侧链；另一方面利用保守性Y164的氢键作用和F143的体积效应维持保守性的H166处于重叠式构象，从而使得该H166以合适的氢键角度和氢键距离作用于底物P1位Gln侧链的羰基，从而完成蛋白酶S1口袋对于底物P1位Gln侧链的识别过程。在催化阶段，该研究一方面证明具有特殊结构GSCGS motif可以稳定底物酶切位点从而便于活性Cys的对于酶切位点进攻，同时维持活性Cys侧链巯基的摆动性。另一方面证明由R40-Y54-D190构成的部分负电中心通过蛋白酶中保守性的水分子介导远程作用从而加速催化反应。

图1. 蛋白酶的催化机制研究。

（1）MERS-CoV与SARS-CoV主蛋白酶在催化过程中的区别

该研究发现MERS-CoV和SARS-CoV主蛋白酶在催化过程中存在明显差别，即MERS-CoV较SARS-CoV的主蛋白酶表现出更好的催化能力和较差的底物结合能力。随后本研究基于研究的催化机制，结合小分子抑制剂探针、结构生物学方法、蛋白突变手段等证明两个病毒主蛋白酶的S1口袋中，保守性Glu残基的外侧区域的二级结构的不同导致了SARS-CoV较MERS-CoV表现出更好的底物结合能力。同时该研究通过分子动力学模拟，蛋白突变等手段证实了两个病毒主蛋白酶中锚定关键性水分子的残基不同导致了MERS-CoV较SARS-CoV表现出更好的催化能力。

图2. MERS-CoV和SARS-CoV 主蛋白酶催化过程中的区别研究。

（2）积极探索催化机制的有效应用

基于所获得的催化机制，本研究积极拓展相应的应用，一方面突变关键区域内的Met为疏水的Leu，通过抑制关键水分子的运动，从而显著地提升了蛋白酶的催化能力，为该蛋白酶的化学生物学应用打下了基础。一方面于抑制剂的P4位引入氢键受体基团以建立抑制剂P4位与关键的氨基酸残基Q195之间的相互作用，从而显著的提升抑制剂的活性多达4倍，为抑制剂的发展提供有力支撑。另一方面，由R40-Y54-D190组成的部分负电中心的部分负电性对于蛋白酶的活性极为重要，同时R40-Y54-D190形成口袋装的表面在蛋白酶底物结合位点的背侧，因此可以基于此口袋，筛选合适的化合物通过影响R40-Y54-D190的部分负电性从而发展新型的冠状病毒主蛋白酶的抑制剂。

图3. 催化机制的应用。

针对新冠疫情的肆虐，尚鲁庆课题组还将新冠病毒的主蛋白酶与之前报道的冠状病毒的蛋白酶进行了序列对比，发现研究的位点均保守地存在于冠状病毒（MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、BCoV-HKU4）主蛋白酶中，揭示了所获得的机制可能是冠状病毒主蛋白酶的通用机制。这为未来应对冠状病毒的变异奠定了研究基础，也为研发抗新型冠状病毒的药物提供了研究依据。

图4. SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV主蛋白酶的序列比对。

该工作得到了上海交通大学赵一雷教授和佐治亚州立大学王炳和教授的大力支持，得到了国家重点研发计划项目，国家自然科学基金和天津市自然科学基金资助。