玉郎伞中miR-144-3p靶向调节双黄酮骨架的发现

导语  

药物分子的手性对治疗靶标的特异性调节功能一直是药物研究领域的热点和难点之一。小RNA（microRNAs，miRNAs）作为近年来疾病发病机制，尤其是肿瘤疾病发病机制研究的热点之一，因其具有较好的物种间保守性而逐渐受到药物研究者的关注。相对于研究较成熟的蛋白靶点，miRNAs由于其前体RNA，即pre-miRNAs晶体结构的缺乏，极大地限制了针对miRNAs的小分子药物设计及其相互作用关系研究。发现并阐明活性小分子天药产物对非编码RNAs的调节作用及其机制是沈阳药科大学李宁教授课题组近年来的主要研究方向之一。近日，沈阳药科大学李宁教授课题组从壮药玉郎伞中得到了一对结构新颖的双黄酮类化合物(−)-millpuline A 及 (+)-millpuline A并通过pre-miR-144立体结构的构建、分子对接、细胞转染等方法首次证实millpuline A的立体构型对其调节miR-144-3p的表达具有决定性的作用，在手性分子调节miRNAs表达及其机制研究领域取得了新突破（Org. Chem. Front., 2019, 6, 2850, DOI: 10.1039/c9qo00678h）。  

前沿科研成果：壮药玉郎伞中miR-144-3p靶向调节双黄酮骨架的发现及机制研究  

沈阳药科大学李宁教授课题组在天然产物非编码RNA调节活性及作用机制方面做了一系列的研究工作（Phytomedicine, 2019, 62, 152941; Front. Genet., 2019, 10, 585; Front. Pharmacol., 2018, 9, 837; Biochem. J., 2016, 473, 1641-1649）。在肺-肠方向上先后建立了基于miRNA异常表达的氧化应激、肿瘤预防、粘膜生长等模型评价体系。为天然活性小分子miRNAs调节作用的快速评价及机制研究奠定了基础。  

在前期工作基础上，作者从玉郎伞（M. pulchra）植物中发现了对miR-144-3p具有靶向作用的(±)-millpuline A，并对其手性拆分、体外全合成及对miR-144-3p/Nrf2通路的调节作用进行了系统研究（Figure 1）。  

Figure 1. The origin, discovery, identification, synthesis and bio-evaluation of the bioflavone (±)-millpuline A.   

（来源： Org. Chem. Front.）  

在分离和鉴定这类化合物的过程中，作者利用¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC确定了(±)-millpuline A的平面结构，通过¹H-NMR谱中关键氢信号的偶合常数和NOESY谱相关信号确定了其相对构型（Figure 2），采用单晶X-衍射的方法确证了(±)-millpuline A的绝对构型（Figure 3）。此外，作者进一步利用ECD计算的方法确定了(±)-millpuline A两种对映异构体的绝对构型（Figure 4）。  

Figure 2. Key HMBC, ¹H–¹H COSY and NOESY correlations for (±)-millpuline A.  

（来源： Org. Chem. Front.）  

Figure 3. X-ray (MoKα) crystallographic structure of (±)-millpuline A.  

（来源： Org. Chem. Front.）  

Figure 4. Experimental and calculated ECD spectra of (1a and 1b).  

（来源： Org. Chem. Front.）  

作者参考millpuline A的生物合成途径，设计了通过2+2光催化环加成反应合成(±)-millpuline A的方法，大量制备得到了这一新颖结构骨架，解决了该成分含量较低不能满足体外活性测试及机制研究的问题。在此基础上，对(±)-millpuline A体外调节miR-144-3p表达的能力进行了评价。在A549细胞中，(±)-millpuline A能够下调miR-144-3p的表达；同时对miR-144-3p的靶基因Nrf2的研究中表明，(±)-millpuline A能够逆转A549细胞转染pre-miR-144所导致的Nrf2蛋白水平的下降，同时(±)-millpuline A亦能够上调Nrf2下游γ-Gcsm的蛋白水平（Figure 5）。  

Figure 5. (A)  RT-qPCR results of (±)-millpuline A (10 μM) decreasing miR-144-3p  expression in A549 cells. (B) Western blot results of (±)-millpuline A  reversing the decline in Nrf2 protein levels induced by  pre-miR-144-elicited miR-144 overexpression. (C) Western blot results of  (±)-millpuline A increasing γ-Gcsm expression.  

（来源： Org. Chem. Front.）  

为了考察(±)-millpuline A下调miR-144-3p表达的潜在作用机制，作者对(±)-millpuline A与miR-144-3p前体RNA（pre-miR-144）的相互作用关系进行了研究。作者首先对pre-miR-144的序列进行了分析，通过预测pre-miR-144的二级结构并结合3d RNA软件最终构建了pre-miR-144的立体结构。随后采用Glide软件分别对(-)-millpuline A和(+)-millpuline A与所构建的pre-miR-144立体结构中茎环部分进行分子对接研究以考察(-)-millpuline A和(+)-millpuline A抑制pre-miR-144茎环部分剪切从而降低miR-144-3p表达的潜在作用能力。分子对接结果表明只有(-)-millpuline A可以与pre-miR-144茎环部位成功对接，提示(-)-millpuline A与(+)-millpuline A对miR-144-3p表达的可能具有完全不同的作用（Figure 6）。  

Figure  6. (A) Computed secondary structure of pre-miR-144. (B) The overall  docking result of (-)-millpuline A binding to the stem loop of  pre-miR-144. (C) The hydrogen bond (yellow) between (-)-millpuline A  (green) and a guanine. (D) Lipophilic pair terms (yellow) between  (-)-millpuline A (green) and pre-miR-144. (E) Electrostatic rewards of  the (-)-millpuline A-pre-miR-144 complex. The electrostatic potentials  were represented in the red, white, and blue colours, respectively. In  the region pointed by green arrows, (-)-millpuline A and pre-miR-144  were in the opposite electrostatic potentials (blue and red,  respectively), contributing to the stabilization of the (-)-millpuline  A-pre-miR-144 complex.  

（来源： Org. Chem. Front.）  

为了进一步的验证分子对接所得结果，作者在对(±)-millpuline A进行手性拆分、富集之后，分别对(-)-millpuline A和(+)-millpuline A调节miR-144-3p/Nrf2通路的作用进行了考察，结果表明(-)-millpuline A和(+)-millpuline A对miR-144-3p/Nrf2通路下游蛋白γ-Gcsm具有完全相反的调节作用，在1 μM的给药浓度下，(-)-millpuline A能够增加γ-Gcsm的表达，而(+)-millpuline A能够显著抑制γ-Gcsm的表达；在特异性高表达miR-144-3p的条件下，只有(-)-millpuline A能够逆转miR-144-3p高表达所导致的Nrf2蛋白表达的降低，从而验证了分子对接实验所得结果（Figure 7）。  

Figure 7. (A) Representative western blot results of (-)-millpuline  A up-regulating γ-Gcsm expression. (B) Representative western blot  results of (+)-millpuline A modulating γ-Gcsm expression. (C) Western  blot results of the effect of (-)-millpuline A and (+)-millpuline A (10 μM) on the pre-miR-144-induced  down-regulation of Nrf2. (D) Relative protein levels for Nrf2 in (C).  Values are means ± S.E.M. from three separate three experiments and are  normalized to the control group.  

（来源： Org. Chem. Front.）  

总结：作者发现了一对结构新颖的对miR-144-3p表达具有相反调节作用的双黄酮类对应异构体(±)-millpuline A。通过ECD计算、体外全合成及手性拆分富集等方法为(-)-millpuline A及(+)-millpuline A的miR-144-3p调节作用研究提供了样品保证。该项工作为首次发现天然产物通过作用于pre-miR的茎环部分从而特异性的降低miRNAs表达，为今后手性药物靶向调节疾病发病关键miRNAs的作用研究奠定了方法学基础。该工作以“Isolation, structure elucidation, and synthesis of (±)-millpuline A with a suppressive effect in miR-144 expression”为题发表在Org. Chem. Front.（DOI: 10.1039/c9qo00678h）上，第一作者为沈阳药科大学天然药物化学专业王雯丽硕士。通讯作者为沈阳药科大学李宁教授和陈刚副教授（论文作者：Wenli Wang, Yingzhan Tang, Yongxiang Liu, Lei Yuan, Jian Wang, Bin Lin, Di Zhou, Lu Sun, Renbin Huang, Gang Chen*, and Ning Li*）。