位阻手性二硫键——药物“靶向释放”的调控开关

靶向载药，如抗体药物偶联体（Antibody-Drug Conjugates, ADCs）和小分子药物偶联体（Small Molecule-Drug Conjugates, SMDCs），是现代药物设计与治疗的新理念。ADC通常由抗体（antibody）、药物（drug）以及连接子（linker）三部分组成：其中抗体会与癌细胞表面的特异性靶点抗原（target antigen）结合“定位追踪”到肿瘤细胞，胞吞透膜进入细胞后，预先设计好的链接子会被特定的酶或高浓度小分子切断，从而达到药物的“精准制导”递送。这种高精度高选择性打击癌细胞的设计，不但可以大幅减少对正常细胞的损害，还可以大大增强药物分子对癌细胞的透膜能力和杀伤能力。这种“魔术子弹”（magic bullet）的思想早在1900年就已被诺贝尔生理学或医学奖得主Paul Ehrlich所提出，然而限于技术上的种种困难，直到百年之后的本世纪初，辉瑞公司才上市了第一个具有这一理念的ADC药物Mylotarg（Blood, 2004, 104, 1995.）。自此之后，ADC药物的开发一直是新药创制中不可或缺的方向，截止2019年底获批上市的ADC药物已有7个，临床在研的数目也在逐年增加（图1a）。更值得一提的是，在这7个已上市的ADC药物中就有2例使用了二硫键连接子：分别是治疗急性髓细胞白血病的吉妥珠单抗（Mylotarg）和治疗急性淋巴细胞白血病的依托珠单抗（Besponsa）（图1b）。

图1. (a) ADC研发趋势; (b)吉妥珠单抗和依托珠单抗结构

在ADC药物设计中，为了能够“定点定时”地释放药物分子，需要根据癌细胞的生理特点进行连接子的设计和使用：既需要保证药物在血浆运输中的稳定性，又需要药物在癌细胞内高效释放。谷胱甘肽，是人体血浆和细胞质中广泛存在的还原性小分子：该分子在血浆中的浓度约为 2-20 μM，而在细胞质中的浓度约为 500-10000 μM。但在癌细胞内，其浓度大约是正常细胞中浓度的4倍，血浆中浓度的1000倍（2000-40000 μM）（Clin. Cancer Res., 1997, 3, 793.）。正是基于这种浓度的差异，可以利用高浓度谷胱甘肽选择性还原切断二硫键，来实现药物靶向释放的目的（图 2）。

图2. 谷胱甘肽与癌细胞内药物的靶向释放原理

那么，二硫键周围的位阻与手性显然是影响ADC药物释放的重要因素。增大二硫键邻位的位阻，例如引入偕二甲基，可确保ADC药物在血浆运输中的稳定性和进入癌细胞后的断裂选择性，这一点已由上市药物Mylotarg 和 Besponsa所证实。同时二硫键旁边引入大位阻环系结构将进一步增强S-S键稳定性（图3）。因此，在二硫键的邻位多样性地引入大位阻，从而实现对链接子的可调控断裂，必将是ADC药物开发与设计的关键因素。但是，传统合成大位阻二硫键通常使用的叔硫醇种类太少且不易获得，使得ADC药物中的二硫链接化学至今进展缓慢。另一方面，由于细胞内切断二硫键的生物酶（谷氧还原蛋白等）以及还原性的小分子（半胱氨酸、谷胱甘肽等）均具有手性环境，那么二硫键邻位的立体效应也会大幅影响药物识别、配位与释放。对于拥有立体结构的二硫醚化合物，与谷胱甘肽分子构型匹配度越高则S-S键更容易断裂。但是由于合成方法的限制，如何获得单一立体构型的二硫键结构，至今尚未有合适的解决方案。

图3. 不同种类二硫键的稳定性

华东师范大学姜雪峰教授团队一直致力于解决复杂二硫体系的构建问题，采用面具效应实现了系列二硫试剂的开发和药物修饰（Nat. Commun., 2019, 10, 2661; Nat. Commun., 2018‚ 9‚ 2191; Angew. Chem. Int. Ed., 2016‚ 55‚ 14121）。最近，该团队针对化学生物学以及药物化学中位阻和手性二硫键合成困难、邻位基团多样性受限等问题，采用N-二硫邻苯二甲酰亚胺试剂与各类叔碳亲核试剂的反应，发展了一种方便快捷的位阻及手性二硫醚构建方法。其条件简单温和，底物范围广，尤其能在二硫键邻位引入多种官能团和环系结构，可以实现邻位位阻的自由变换（图4）。

图4. 位阻与手性二硫键的构筑新方法

首先，该工作采用各种大位阻碳亲核试剂进行二硫化选择性偶联，大幅拓展了位阻二硫键的范围，包括邻位的偕二甲基、偕二苯基，呈螺环的环丁基、环戊基、环己基等季碳二硫醚结构，从合成的角度突破了现有位阻二硫键构建的局限，并实现了邻位位阻的自由变换。并且，利用分子内含有羧基或羟基的二硫试剂，可进一步进行分子的衍生和链接：例如甘氨酸5a，二肽化合物5b，β-巯基葡萄糖5c，鬼臼毒素5d，天然产物δ-生育酚5e，以及荧光素5f等功能分子，均可以使用该方法高效嵌入位阻二硫键结构。此外，该位阻二硫链接策略还顺利实现了功能双分子的杂交：将叔碳亲核试剂（茚酮酮酸酯）作为模块嵌入，可以将氨基酸与氨基酸（丙氨酸与丙氨酸5g），氨基酸与荧光分子（苯并氨酸与香豆素5h），氨基酸与糖类（丙氨酸与半乳糖5i），氨基酸与核苷类（异亮氨酸与脲苷5j），不同疗效的药物（吲哚美辛与青蒿琥酯5k，吲哚美辛与鬼臼毒素5l）均可通过具有螺环位阻的二硫键相链接。这些代表性的例子表明，该位阻二硫键链接的策略不但可以为生命分子的修饰、新型药物的开发提供有力的工具，还有可能成为药物机制检测跟踪的有效手段（图5）。

图5. 功能分子的螺环位阻二硫链接

此外，由于S-S本身的柔性和不稳定性，同时硫原子又极易导致金属催化剂配位毒化，因此通过不对称催化二硫转移反应实现手性二硫的合成是一项巨大的挑战。姜雪峰教授团队巧妙地运用二氢奎尼定1,4-(2,3-二氮杂萘)二醚（(DHQD)₂PHAL）作为手性诱导催化剂，组合利用催化剂本身的空间位阻效应（两个奎宁定所构筑的空腔）、静电吸引作用（铵盐与烯醇负离子）、芳基间π-π稳定效应（二氮杂萘与邻苯二甲酰亚胺）以及邻苯二甲酰亚胺的氢键绑定作用，实现了二硫邻位的立体选择性引入，不对称诱导效果可达90% ee以上，重结晶后可达98% ee。这些含有手性季碳中心的二硫醚立体构型最终通过6d的单晶结构得以确认。高立体选择性二硫醚的建立，将为偶联-杂交药物的手性识别和立体选择性释放提供结构基础（图6）。

图6. 手性二硫键的高选择性构建

Steric and Stereoscopic Disulfide Construction for Cross-linkage via N-Dithiophthalimides

Wenchao Gao, Jun Tian, Yuzhu Shang, Xuefeng Jiang

Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/D0SC01060J