抗肾癌化合物Englerin A的化学半合成

近日，武汉大学药学院刘天罡教授课题组与德国柏林自由大学Mathias Christmann教授课题组在JACS 联合发表研究论文，他们以微生物合成的倍半萜骨架guaia-6,10(14)-diene为底物，通过化学半合成方法实现了植物源明星分子englerin A的经济高效合成。

天然产物是药物的一个重要来源，高纯度产物的高效获取以及规模化生产是天然产物药物生产过程中不可回避的重要问题。目前研究人员可通过天然产物直接分离以及有机合成等方式获得目标化合物。然而，常受限于原料来源受限、产物含量低、纯化/合成工艺复杂以及环境污染大等问题而难以大规模应用。此外，由于绝大部分天然产物来源药物生物合成途径尚未阐明，这也限制了利用生物合成方法直接生产这些产物。

研究发现大戟科植物Phyllanthus engleri中含有氧桥结构的愈创木烷类倍半萜类化合物englerin A具有显著的抗肾癌活性。然而，迄今为止与其生物合成途径有关的细胞色素P450酶以及一系列后修饰酶仍不为人所知，而挖掘并阐明这些分散于基因组中的功能基因则是一个费时费力的过程，这使得利用生物合成方法直接生产该产物变得遥不可及。萜类产物的合成通常是由不同链长的异戊二烯单元缩合环化形成核心骨架，随后经由一系列的氧化以及后修饰过程合成结构多样的萜类化合物（图1）。这一模块化的合成方式为我们利用化学半合成方法合成englerin A提供一个良好的契机。

图1. 生物活性萜类化合物的模块化合成

丝状真菌来源的guaia-6,10(14)-diene与englerin A含有相同的核心骨架，这暗示可以利用guaia-6,10(14)-diene为底物通过化学半合成方法合成englerin A。为此，作者以文献报道的STC5为探针，系统地筛选了真菌来源的倍半萜合酶并从禾谷镰刀菌Fusarium graminearum J1-012中找到了一个高效合成guaia-6,10(14)-diene的倍半萜合酶FgJ02895。随后他们以大肠杆菌以及酿酒酵母体为平台，通过代谢工程手段改造并加强甲羟戊酸途径以及下游的guaia-6,10(14)-diene合成途径，实现guaia-6,10(14)-diene的高效合成。构建了一系列大肠杆菌突变株，并在突变株E. coli G5将englerin A产量提升到0.5g/L。在酿酒酵母体内，借助于CRISPR/Cas9技术，系统地增强了上游底物供给以及下游guaia-6,10(14)-diene合成途径，在突变株S. cerevisiae YL06体内将englerin A产量提升到0.8g/L。这为通过化学半合成方法合成englerin A以及工业化生产奠定了坚实的基础（图2）。

图2. 代谢工程改造大肠杆菌与酿酒酵母高效合成guaia-6,10(14)-diene

随后，Mathias Christmann教授课题组以微生物合成的guaia-6,10(14)-diene为底物，利用化学半合成方法实现了(-)-englerin A的高效合成。首先在钴催化下guaia-6,10(14)-diene环外双键异构化得到中间体3（产率73%），接着采用Sharpless不对称催化进行选择性双羟基化，获得单一异构体中间体4（产率83%），随后4经二甲基过氧化酮（DMDO）氧化得到单一非对映异构体产物7，加入冰醋酸后使环氧键开环获得中间体8（产率75%），后与肉桂酸（cinnamic acid）完成酯化并采用TBAF试剂脱去羟基保护基得到目标产物EA（产率85%）（图3）。

图3. (-)-Englerin A的化学半合成

同时，为了探究该策略的通用性，本研究还以guaia-6,10(14)-diene为底物，成功地实现了天然产物(−)-oxyphyllol (10) 和(+)-orientalol E (11)的化学半合成。首先，本文通过DMDO氧化试剂以丙酮作为溶剂对guaia-6,10(14)-diene进行环氧化得到非对应异构体9a和9b，随后用氢化铝锂进行环氧键开环，并用稀盐酸进行成环获得产率为81%的(−)-oxyphyllol (10)。产物10可进一步经由乙酰化、氧化和皂化等步骤生成(+)-orientalol E (11)，产量为48%（图4）。

图4. Guaia-6,10(14)-diene衍生物(−)-oxyphyllol及(+)-orientalol E的化学半合成

综上，本研究通过代谢工程改造方法在酿酒酵母体内实现了丝状真菌来源倍半萜化合物guaia-6,10(14)-diene的0.8g/L的高效合成，随后通过七步化学半合成高效获得植物源明星分子englerin A。该方法englerin A的总产率为38%，代表了迄今为止最短和最高的产率，为这一产物的规模化生产奠定了坚实的基础。此外，利用化学半合成方法还实现了guaia-6,10(14)-diene衍生物(−)-oxyphyllol及(+)-orientalol E的高效合成，展示了以微生物合成的萜类核心骨架为底物化学半合成高度氧化修饰的萜类产物的潜力。可以预期，这种建立在微生物合成与有机合成优势上的化学半合成方法将为合成具有复杂结构的生物活性萜类天然产物提供一个高效通用的方案。

Semisynthesis of Plant-Derived Englerin A Enabled by Microbe Engineering of Guaia-6,10(14)-diene as Building Block

Thomas Siemon, Zhangqian Wang, Guangkai Bian, Tobias Seitz, Ziling Ye, Yan Lu, Shu Cheng, Yunkun Ding, Yanglei Huang, Zixin Deng, Tiangang Liu*, Mathias Christmann*

J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 2760-2765, DOI: 10.1021/jacs.9b12940