天然产物合成灵感哪里来？

大自然无疑是最伟大的化学家，数量庞大、结构多变、活性丰富的天然产物就是她的杰作。这样说来，天然产物的全合成，就像人类化学家在合成领域与她进行的深邃对话。当前的天然产物全合成按照其实现方式可分为两大“门派”，一派走有机反应合成路线：基于缜密设计，通过若干步反应高效、精确合成目标产物，堪称“化学艺术”。从R. B. Woodward到E. J. Corey、K. C. Nicolaou，还有现在如日中天的P. S. Baran等等，都是这一门派代表人物。另一派则是在生物遗传学指导下，利用“生物合成基因—合成酶—天然产物”机制合成目标产物。尤其是在聚酮合酶（PKS）和非核糖体肽合成酶（NRPS）领域，成果丰硕，充满“生物智慧”。那么，这两大门派的研究有没有交叉呢？当“生物智慧”邂逅“化学艺术”，又会迸发出怎样的火花？美国洛克菲勒大学的Sean F. Brady教授团队，近期就做了这样一例“从生物中来到化学中去”的交叉研究。

Sean F. Brady教授。图片来源：Rockefeller University

近年来，大量资源投入到人类微生物基因组的测序和生物信息学分析中，揭示出越来越多的天然产物生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs），其中不少BGCs在自然条件下并没有表达，也就不参与生物合成，称为“沉默BGCs”。对于学术界来说，“沉默BGCs”相当于一个有待开发、潜力巨大的信息库。那么如何去开发它呢？Sean F. Brady教授没有走“基因表达—酶—合成天然产物”的大众路线，而是采用“合成-生物信息天然产物（synthetic- Bioinformatic Natural Products, syn-BNPs）”方法，用生物信息学算法代替基因转录、翻译和体内酶催化的天然产物生物合成，从而预测这些沉默BGCs的产物，随后再进行体外化学合成。

他们以人类微生物基因组中的非核糖体肽合成酶（NRPS）的BGCs为研究对象，希望在“syn-BNPs”方法指导下，利用固相多肽合成技术，合成出生物活性好、结构多样的天然产物环肽。他们分析了1298条人类相关细菌的NRPS-BGCs，从中筛选鉴定出48条有价值的沉默NRPS-BGCs，其中25条适合syn-BNPs的结构预测。这48条BGCs超过一半来自口腔细菌，其余分别来自胃肠道、皮肤、泌尿生殖道、呼吸道和血液。从分类上看，这些BGCs主要来自变形菌门，其次是放线菌门和厚壁菌门（图1）。

图1. 生物信息学分析人类基因组鉴定出48条NRPS BGCs。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

有趣的是，这与从其它环境中分离培养的细菌种群结构有很大的区别。一般情况下，放线菌门被认为贡献的活性天然产物最多，本实验贡献BGCs最多的中却是变形菌门。拟杆菌门被认为在人类微生物种群中最常见。但是在实验中，该类细菌未贡献目标BGCs。意外也许是新发现的起点，Sean F. Brady坚信筛选出的NRPS-BGCs是指导下一步环多肽合成的“理想说明书”。

虽然获得的“说明书”对于多肽序列的预测非常好，但是却难以预测环化的模式。在经典的NRPS生物合成中，多肽环化因内部亲核试剂的不同，可分为三种模式，分别是：（1）多肽链N末端作为亲核试剂（cHT式）；（2）氨基酸侧链作为亲核试剂（cSC式）；（3）在N-酰化多肽中一端的脂肪酸上N可作为亲核试剂（cFA式）（图2a）。

图2. (a) 25条BGCs生物信息学预测多肽与化学合成；(b) 合成3种一般环肽构型的方案。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

既然不确定是哪一种环化模式，那就3种都合成吧。他们选择固相多肽合成技术，针对每一个NRPS-BGCs合成了上述3种模式环肽。他们对已知环状非核糖体肽（NRP）分析显示，如果存在2个以上的亲核侧链，主体结构成环倾向于形成最大环，而含脂肪酸的环肽经常通过脂肪酸的-氧化成环。基于这些分析，他们用2,3-二氨基丙酸代替丝氨酸/苏氨酸进行侧链环化，用3-氨基癸酸合成所有含脂肪酸的环肽（图2b）。

他们从25条NRPS-BGCs中预测出30条多肽序列，共合成86个syn-BNP目标环肽，其中4个多肽因为没有任何亲核氨基酸，无法合成侧链环肽而排除。经过一系列化学处理以及高压液相色谱纯化，最后得到72个目标环肽用于生物分析。

他们将获得的环肽进行生物活性测试。首先筛选其抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）的能力。遗憾的是，没有筛选到任何环肽有抑制上述细菌、真菌的能力。随后，他们用MTT代谢活性分析法，测试了环肽对人宫颈癌细胞系（HeLa细胞系）的抑制能力（图3），得到了5个活性环肽（syn-hoagimin A、syn-hoagimin B、syn-rhodomin、syn-parascrofin、syn-kroppenstin，图4）。

图3. (a) 单剂量syn-BNP环肽抑制细菌、真菌、HeLa细胞生长的作用；(b) 活性syn-BNP环肽对HeLa细胞生长抑制作用的量效曲线。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

为了验证观察到的活性，Brady团队将活性好的5个环肽重合成、纯化，并用高分辨质谱鉴定，然后用MTT法重新测试。在4种细胞系（HeLa、HT-29、A549、NCl-H1299）测试中，5个环肽显示了从微摩到纳摩的抑制活性。在这些活性环肽当中，syn-rhodomin和syn-hoagimin的BGCs来自Rhodococcus hoagii，分离自人类皮肤，是一种条件致病菌。Syn-parascrofin的BGCs来自细菌Mycobacterium parascrofulaceum，分离自人类呼吸系统，也是条件致病菌。Syn-kroppenstin的BGCs来自细菌Kroppenstedtia eburnea，是一种好氧、产芽孢的革兰氏阳性菌，可来自人类和其他自然环境，此菌致病性还有待确认（图4）。

图4. 具有生物活性的syn-BNP环肽结构和其细菌基因组来源。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

以往研究通过生物信息学挖掘“沉默生物合成基因簇”，往往是创造合适的生物化学环境让其表达，例如将基因簇异源表达，然后再检测其合成的天然产物。Sean F. Brady团队用生物信息学+有机化学合成的方式，直接”破解“出沉默天然产物生物合成基因簇里的信息，合成出结构新颖复杂，生物活性好的环肽。这样的操作堪称“生物智慧”与“化学艺术”结合的完美范例。