大家都知道，蛋白质的氨基酸序列和功能化修饰决定了它们的生物学功能。蛋白质的氨基酸序列如果出现了不需要的突变，就很可能无法正确履行功能，从而导致一系列的疾病和健康问题。而蛋白质氨基酸残基的功能化修饰，也经常引起蛋白质功能的巨大变化，比如，个别关键位点的丝氨酸或苏氨酸的磷酸化，就可以使某些细胞信号通路中的激酶从无活性状态变为有活性的状态，从而激活或者关闭信号通路。研究蛋白质结构和功能的关系，对于理解生命活动、寻找药物靶标和新药发现都非常重要。不过蛋白质序列很长，研究不易，而短得多的寡肽也可以自组装成刺激响应性的仿生超结构，可以用来在一定程度上模拟自然界中蛋白质的组装，此外还能作为多功能生物材料，这引起了研究者的巨大兴趣。由肽链和糖构成的糖肽，在生命系统中也占据着很重要的作用。不过糖肽中蛋白质序列对于糖肽自组装影响的研究目前并不充分。
最近，温州医科大学的周云龙研究员和密歇根大学安娜堡分校Shuai Wei博士等人利用结构简单的三肽（即Ala-Gly-Gly-OH、Gly-Ala-Gly-OH、Gly-Gly-Ala-OH），研究了序列上的细微变化如何影响糖肽分子自组装成高度有序的纳米结构。三肽的N末端和C末端分别用疏水性的正丁基偶氮苯和亲水性的N-甲基-D-葡糖胺残基（衍生自葡萄糖的氨基糖醇）修饰，其中偶氮苯基团赋予偶氮苯-糖肽（AGP）自组装能力和刺激响应性。当Ala残基的位置在三肽中变化时，在相同条件下作者观察到来AGP出现三种不同的自组装一维形貌：纳米扭带、纳米带和纳米纤维。作者还通过透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和圆二色（CD）光谱对这些AGP组装体进行了表征，并使用Martini粗粒度分子动力学（MD）模拟研究了组装机制的差异。此外，AGP组装体在响应光、热或主客体化学时显示出可逆的分解-组装过程，而且具有可调控的生物膜（biofilm）抑制和消除活性。
作者在合成三肽AGP之后，将AGP粉末在70 ℃下以所需浓度完全溶解在水中，然后冷却至室温进行自组装，制备AGP组装体和水凝胶。他们根据TEM和AFM成像来测量AGP纳米结构的宽度和高度。对于AGP1，作者观察到螺旋间距为202±12 nm的左手螺旋的纳米扭带。而AGP2和AGP3都没有像AGP1那样呈扭曲结构，不过AGP2纳米结构的宽度和高度为18.5±3.1 nm和7.1±0.8 nm，更像是平面的纳米带；而AGP3纳米结构的宽度和高度分别为6.9±1.1 nm和6.3±1.5 nm，更像是圆柱形的纳米纤维。这就很有意思了，只是改变Ala残基的位置，就可以得到三种不同的一维形态。作者猜测，Ala残基位置变化引起了肽侧链相互作用的变化，可能会影响AGP分子的内部堆积，从而影响一维组装体的形貌。作者还通过XRD、FT-IR、CD等进一步研究了AGP组装体的结构细节。Martini粗粒度分子动力学模拟结果也确认了三种AGP自组装体形貌的巨大差异，并反映出不同的自组装机制。
此前提到，AGP结构中的偶氮苯单元赋予了AGP组装体刺激响应性，作者接下来研究了AGP组装体对于光、热和主客体化学的刺激响应性。加热至70 ℃后，偶氮苯的CD信号消失；冷却至20 ℃后，CD信号几乎完全恢复。该可逆过程可以重复至少3个循环。作者认为，这中热响应可归因于弱分子间相互作用，分别在70 ℃和20 ℃下可逆地破坏和恢复。UV照射10分钟后，未检测到偶氮苯的CD信号；而在可见光照射60分钟后，CD信号几乎恢复。该可逆过程也可重复至少3个循环。作者认为，由于偶极矩的增加，紫外诱导的顺式偶氮苯比其反式结构更亲水，并且偶氮苯分子结构也会变化，并可能限制AGP分子在组装体内的紧密堆积。而在可见光照射下，偶氮苯逐渐恢复成原先的反式结构，从而导致CD信号的恢复。具有亲水外部和疏水内腔的β-环糊精（β-CyD）可以包封AGP分子的正丁基偶氮苯单元，在室温下将β-CyD加入到AGP组装体中时，偶氮苯的CD信号在几分钟内消失，表明发生了快速的主客体复合过程。而加入竞争性客体分子2-金刚烷胺盐酸盐（ADA）之后，AGP被释放，恢复了之前因为β-CyD加入而解体的AGP组装体一维纳米结构。这些结果证明了AGP组装体的多刺激响应特性。
那么，这种AGP组装体有什么潜在应用呢？此前已经有报道表明了多价糖肽树枝状大分子可以抑制细菌生物膜，这让作者想到可以尝试测试AGP组装体的抗生物膜活性。所谓生物膜，是在物质表面上形成的微生物群落，由多糖、蛋白质、DNA、脂质等组成的细胞外基质结合在一起。据估计，高达80％的细菌感染伴随着生物膜的形成，而且生物膜中的细菌比游离状态的细菌对抗生素以及人体免疫应答要更具抗性，严重威胁健康。作者测试了三种AGP组装体对于抗甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的活性，可喜的是，AGP1、AGP2和AGP3组装体在多种测试中都表现出了抗生物膜的活性。此外，这种抗生物膜的活性还可以通过主客体相互作用来调控。在加入β-CyD进行主客体复合之后，AGP1组装体的生物膜抑制活性消失；随后加入ADA竞争性结合β-CyD并释放出AGP1之后，生物膜抑制活性几可完全恢复。因为细菌的细胞壁通常由肽聚糖中的大量糖基组成，所以细菌表面能够与具有相似结构的分子形成大量氢键。而自组装AGP纳米结构含有多价三肽-糖胺基团，对细菌细胞壁具有极强的亲和力。因此，作者推测AGP组装体与细菌表面的亲和力通过减弱细菌与生物膜的附着而导致生物膜的逐渐去除，造成生物膜生物质的减少。而在加入β-CyD进行主客体复合之后，AGP组装体的纳米结构被分解并且所得的AGP/β-CyD复合物对细菌细胞壁的亲和力低得多，无法与细菌结合，失去了生物膜去除功能。
综上，周云龙研究员和Shuai Wei博士等人利用结构简单的三肽研究了氨基酸残基序列的变化对于糖肽分子自组装形成纳米结构的影响。他们通过在三肽的N末端修饰疏水性的正丁基偶氮苯，使得AGP可以自组装并可响应外界刺激。AGP中Ala残基的位置变化，导致了三种不同的自组装一维形貌：纳米扭带、纳米带和纳米纤维。此外，AGP组装体具有生物膜抑制和消除活性，并且这种活性可以通过主客体化学进行调控，使得AGP组装体有望成为一种智能抗菌纳米材料。
Sequence isomerism-dependent self-assembly of glycopeptide mimetics with switchable antibiofilm properties
Limin Chen, Jie Feng, Dan Yang, Falin Tian, Xiaomin Ye, Qiuping Qian, Shuai Wei, Yunlong Zhou
Chem. Sci., 2019, DOI: 10.1039/C9SC00193J
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