一串神秘代码引发的微生物王国“信息战”

战争爆发地点：澳大利亚昆士兰州，Heron岛的浅水海滩；

交战双方：细菌王国的链霉菌（Streptomyces sp.）vs. 真菌王国的曲霉（Aspergillus sp.）；

战争的武器：链霉菌能产生多样化的抗真菌次级代谢产物，同样，曲霉也能产生抗细菌的化合物，并且交战双方含有大量沉默的生物合成基因簇（silent biosynthetic gene cluster，简称BGC）能合成对抗对方的次级代谢产物（潜在的新式武器库）；

战争的信息化系统：高效、快速、专一的化合物信号，而这个神秘化合物的揭示，是本文研究的焦点。

那么，这个化合物到底是什么？下面请跟随Robert J. Capon团队的实验设计思路去一步一步揭晓答案。

Robert J. Capon课题组从澳大利亚昆士兰州Heron岛的浅水海滩海沙中分离到链霉菌CMB-M0423，并从中得到一个稀有的法尼酰化-2-硝基吡咯类化合物heronapyrrole B（化合物1，图3）。化合物1的存在，使得他们假设如果一氧化氮酶（NOS）抑制剂存在时，培养链霉菌会抑制一氧化氮（NO）的产生，并生成化合物1的脱硝基类似物，这样有可能获得新型的抗菌化合物。于是，他们将链霉菌CMB-M0423暴露培养于NOS抑制剂氨基酸胍（AG），意外发现脱硝基类似物没有产生，却产生了6种真菌的代谢产物，这其中包括cyclo-(L- Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)（化合物3，图3）。如果分别用另外两种NOS抑制剂，N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和N-甲基-L-精氨酸（L-NMMA）处理链霉菌，也会出现相似效果。这些结果提示他们链霉菌中隐藏了真菌，heronapyrrole B具有抑制真菌的活性，使得真菌处于受抑制状态（链霉菌占上风）。氨基酸胍的存在抑制了heronapyrrole B（化合物 1）的生物合成，使得真菌和其代谢产物开始占主导地位。链霉菌CMB-M0423事实上是混合菌。

图3. 化合物heronapyrrole B (1)、debromomarinone (2)、cyclo-(L- Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro) (3) 结构。图片来源：ISME J.

他们对CMB-M0423进行纯化培养，分别得到链霉菌CMB-StM0423和曲霉CMB-AsM0423（图 4）。令人吃惊的是，曲霉CMB-AsM0423的代谢产物3显示针对链霉菌CMB-StM0423的抑制活性，同样，链霉菌CMB-StM0423产生的化合物1也针对性抑制曲霉CMB-As M0423，两株菌在琼脂平板共培养时，会出现彼此都无法生长的冲突区域，可见双方火药味十足，都有精确打击对方的武器。

图4. 链霉菌CMB-StM0423（右）和曲霉CMB-AsM0423（左）的电子显微镜照片。图片来源：ISME J.

由于链霉菌单独培养时不会产生化合物1，这使得他们推测曲霉的一个或多个代谢产物可能扮演了信号角色，激活链霉菌中沉默的heronapyrrole生物合成基因簇转录。于是，他们用6种曲霉代谢产物一一分别与链霉菌共培养，发现只有化合物3能够刺激化合物1的生物合成。由于3是一个二酮哌嗪类化合物，他们猜测二酮哌嗪可能是这类细菌-真菌共培养代谢产物活化的关键性化合物。于是，他们合成了一系列二酮哌嗪，分别是化合物4-13（图5），去评估它们激活链霉菌合成产物1的能力，结果显示这些化合物都无法像3一样有显著激活能力。这说明关键性化合物并非二酮哌嗪。

图5. Robert J. Capon团队合成的二酮哌嗪化合物结构（4-13）。图片来源：ISME J.

由于在前面的研究中，链霉菌heronapyrrole的生物合成被NOS抑制剂氨基酸胍所阻断，那么这类化合物的转录活化会不会是NO介导的呢？为了验证这个假设，他们设计了一系列实验：（i）链霉菌CMB-StM0423和化合物3共培养，产生了NO和化合物1；（ii）链霉菌单独培养，既不产生NO也不产生化合物1；（iii）链霉菌和曲霉共培养，产生NO和化合物1。这些观察结果证实了链霉菌在激活体系下产生NO和1，但是无法说明3和NO谁是激活链霉菌产生1的关键化合物。于是他们继续设计附加实验：（i）链霉菌、化合物3和内源NO剪切剂CPTIO共培养，没有产生1，证明只有3没有NO的不足以活化链霉菌产生1；（ii）链霉菌和内源NO供体DEANO共培养，也产生1，说明单独的NO能够激活1的产生。综合以上实验结果证明化合物3诱导NO的产生，而且NO能够绕过3诱导1的产生。NO才是诱导化合物1的关键。也就是说，在链霉菌与曲霉的王国战争中，NO是开启战端的神秘代码。

随后，Robert J. Capon课题组使用单分子实时测序（SMRT）技术，结合基因组比对分析，证实链霉菌CMB-StM0423属于能够高效产生类异戊二烯化合物的MAR4家族成员。链霉菌CMB- StM0423含有27个生物合成基因簇，可编码9种特征性异戊二烯。进一步挖掘链霉菌的基因组信息，鉴定出3种NO代谢相关酶—黄素腺嘌呤还原酶（XOR）、硝酸盐/亚硝酸盐（NiR/NaR）同系物序列。为了分析这些序列表达物与化合物1生物合成的关系。他们使用转录表达分析技术，以研究针对化合物3的转录响应。分析发现化合物3激活了XOR、NiR/NaR的转录，使得生物合成基因簇（BGC）11显著上调，而BGC11极有可能参与了化合物1的生物合成。所有这些研究验证了化合物3在转录活化NO中的角色。也就是说，化合物3是曲霉的武器，专一性针对链霉菌；链霉菌在NO信号介导下开启自己的武器库BGC11，产生反击曲霉的武器化合物1（图6）。

图6. 链霉菌CMB-StM0423和曲霉CMB-AsM0423相互抑制示意图。图片来源：ISME J.

Robert J. Capon课题组发现NO在链霉菌CMB-StM0423中扮演一个沉默BGCs的转录调节因子作用，这使得他们推测NO介导的转录活化（NOMETA）在其它细菌微生物中也可以用于活化沉默BGCs。于是，他们将NOMETA运用于一系列链霉菌中，在产生制霉菌素、达托霉素、杀稻瘟灵的三种链霉菌上均发现了NOMETA现象。

综合前面的研究结果，他们大致揭示出这场战争的全貌：在澳大利亚昆士兰州Heron岛的一处海湾，栖息于同一生态环境的链霉菌CMB-StM0423和曲霉CMB-AsM0423为争夺生存资源相互抑制，其战争爆发的信号是神秘代码NO。在NO介导下，链霉菌沉默的生物合成基因簇BGC激活，产生化合物1抑制曲霉。曲霉CMB-AsM0423的反击，是通过产生真菌代谢产物化合物3进行，包括3在内的真菌代谢产物针对性抑制链霉菌。信息化战争中，掌控核心信息是胜败的关键，同样，在这场微生物王国战争中，NO是战争的胜负手。外源递送NO或提供内源NO的供体（NO气体、DEANO），都可以激活链霉菌BGC，产生1，使得链霉菌占上风，反之，提供NO合酶抑制剂（AG、L-NAME或L-NMMA），或NO剪切剂，使得链霉菌BGC沉默，曲霉代谢产物3上升，使得战争天平倾向于曲霉（图 6）。

那么，研究这场微生物战争有何现实意义呢？微生物沉默BGCs是新型药物开发的巨大宝库，但是这个宝库往往不好打开，本文中NO介导的转录活化（NOMETA）可能在未来会成为打开这个宝库的钥匙，为天然微生物来源的药物研发开辟一条新的路径。

Inter-Kingdom beach warfare: Microbial chemical communication activates natural chemical defences

ISME J., 2019, 13, 147-158, DOI: 10.1038/s41396-018-0265-z