2016年拉斯克临床医学研究奖

2016 年拉斯克临床医学研究奖被授予给三位科学家：来自德国海德堡大学的Ralf F. W. Bartenschlager、来自美国洛克菲勒大学的Charles M. Rice和来自Arbutus生物制药公司的Michael J. Sofia。他们开发出一种系统来研究导致丙型肝炎的病毒（即HCV）的复制，并且利用这种系统引发这种慢性的而且经常是致命性的疾病的治疗变革。10多 年来，Bartenschlager和Rice试图诱导丙型肝炎病毒（HCV）在实验室培养的宿主细胞内增殖。他们克服了一个又一个挑战，最终取得成功。 基于类似的毅力和想象力，Sofia（之前在Pharmasset公司任职，如今在Arbutus生物制药公司任职）随后利用这种系统测试和发明候选药 物，它们的新设计允许靶向HCV所在的肝脏和构建具有史无前例的强效性和安全性的药物。

在全世界，HCV导致1.3～1.7亿人遭受慢性肝脏感染，并且每年导致35万多人死亡。目前没有可用的疫苗，而且如果不加以治疗，大约15%～30%的感染上HCV的人患上肝功能衰竭或肝癌。在Bartenschlager、Rice和Sofia的研究之前，采取的疗法包括服用很多人不能够耐受和经常不会治愈这种疾病的毒性药物。

达成共识

为了研究一种病毒和开发抵抗它的药物，科学家们需要一种在实验室培养它的方法。自从1989年分离出HCV以来，Michael Houghton（2000年拉斯克临床医学研究将得主）为了此目的，已开发出一种新的方法。研究人员可能利用标准的重组DNA技术来产生这种病毒的 RNA。在将它导入细胞中后，他们期待这种宿主将利用这种遗传密码产生传染性的HCV。

这种方法失败了。

当研究人员试图促进HCV在细胞中复制时，他们开始想知道他们是否获得它的完整序列。了解到病毒制备方法能够引入错误后，Rice（当时还在华盛顿大学） 和博士后研究员Alexander Kolykhalov开发出一种确定完整的HCV RNA同时避免这些技术缺陷的方法。

1996年，他们的策略在这种病毒的末端揭示出一种未曾预料的结构。这一发现提示着所有的有结构的基因组不能够在实验室中复制，这是因为它们缺乏这个至关重要的特征。

在满怀较高的希望下，Rice构建出一系列包含这一末端的HCV序列，并将它们注射到黑猩猩体内。不幸的是，这些RNA不会产生肝炎或其他的感染迹象。

他无所畏惧地开展进一步分析，结果发现这些RNA已发生序列变化---在实验室中扩增时，或者在那之前，即这种病毒在被感染者体内发生复制时。他推断到， 这些序列错误会削弱HCV的增殖能力。他构建出“一致性（consensus）”基因组---在每个位置，都保持最为常见的RNA碱基而不是一种有害的碱 基。

Rice和来自美国国家卫生研究院（NIH）的Jens Bukh在1997年独立地报道由此所产生的HCV RNA感染黑猩猩并且让它们感染上肝炎。研究人员已在实验室中设计和制造出一种功能性的HCV病毒。当然，这些一致性RNA会在实验室培养的细胞中产生 HCV，因此允许研究人员分析它的详细生物学特征。

复制成功

与此同时，Bartenschlager（当时在德国美因茨大学）已获得一种不同的一致性HCV序列。他将它导入多种宿主肝细胞中，但是从未检测到HCV复制。Rice的一致性序列也在这项测试中失败了。

Bartenschlager有一个想法。他知道与HCV存在亲缘关系的病毒可能丢失它们的基因组的一部分---编码病毒包装蛋白的区域---然而仍然能够在宿主细胞中增殖。他想知道他是否能够利用一种让含有复制性HCV的细胞暴露出来的遗传标志物替换这些可有可无的序列。

在二十世纪九十年代晚期，他和博士后研究员Volker Lohmann切断他们的一致性RNA，并且插入一种基因---它的表达产物会对一种致命性的药物产生耐药性。如果拷贝HCV RNA的复合体确实发挥作用的话，那么它将不仅扩增病毒RNA，而且也扩增这种耐药性基因。因此，携带这种“复制子（replicon）”的宿主细胞将会 抵抗这种致命性的药物。

这个计划成功了。这些复制子给宿主肝细胞赋予存活优势的能力允许研究人员在实验室中检测HCV复制。不过，当他们在庆祝时，他们还是皱了皱眉头。存活下来的细胞含有上千个RNA，而且在每一百万个接受这些RNA导入的细胞中，大约仅有一个细胞存活下来。

Rice和Bartenschlager独立地证实这些大量增殖的复制子获得细胞内的适应性序列变化。在研究人员将这些增强复制的突变引入回这种起始的RNA后，被感染的细胞数量增加了500～10000倍。 研究人员首次在实验室中实现高效的HCV复制。因为这些复制子并不产生感染性的病毒颗粒，所以这种系统能够被安全地使用，同时无需采取高水平的预防措施。再者，这些微型基因组（mini-genome）编码在HCV增殖中发挥关键性作用的可作为重要药物靶标的蛋白。

发现新的HCV治疗药物

如今，制药行业有一种可控的方式来测试候选试剂是否抑制活的肝细胞内的HIV病毒。新的药物是迫切需要的。标准的治疗方案需要每周注射干扰素，但这会产生严重的副作用。再者，这种治疗需要24～72周，而且经常失败。

在努力改善治疗的过程中，来自Pharmasset公司---由Raymond Schinazi创办的一家小型生物技术公司---的科学家们着重关注HCV的RNA复制酶。它的活性位点在不同的HCV基因型之间是相似的，而且它在人 类中不存在同源物，因此该团队可能能够开发一种会抵抗多种HCV基因型同时不会破坏宿主生理学功能的抑制剂。

研究人员将他们的注意力投向一种类似于正常的RNA构成单元的但是在一种至关重要的方式上存在差别的化学物。这些所谓的核苷类似物附着到一条不断增长的 RNA链上，但是当将这种复制酶试图加入下一个亚基时，它不能够附着。这些类似物的额外化学基团会产生干扰，而且RNA延伸步骤停止了。

在2006年，作为Pharmasset公司团队的一员，Jeremy L. Clark鉴定出一种阻断这种复制子系统中的HCV复制的核苷类似物。在人类中，它的安全性看起来是大有希望的，但是它的大多数分解为一种无活性的形式。

通过修改它的化学性质，Pharmasset公司团队（如今在Sofia的领导下）解决了这些问题。在2010年，他们报道他们的改进型核苷类似物当与一类不同的抑制一种不同HCV酶的药物组合使用时会降低病毒载量，而且经常大剂量地服用这种类似物是必需的。

为了提高它的强效性，Sofia偶然想到一个非常规的想法。该团队的研究揭示出这种原始的类似物可能并不是尽头。通过一系列反应，体内的酶将它的一小部分转化为一种不同的抑制HCV复制并且在肝细胞中长期保持完整的化合物。

为了利用这种强大的和稳定的抑制剂，Sofia不得不克服一个巨大的挑战。他需要提供的并不是这种原始的类似物，而是一种特定的分子相关物，这是因为这种类似物不会高效地转化为所需的化学物。这种分子相关物携带一种磷酸根，它的负电荷使得它不能够跨越油性的细胞膜。

Sofia和他的同事们想要遮盖住这个磷酸根，因此这种化合物会溜进细胞中。在他的想象中，肝酶随后将这种试剂的磷酸根去除，而且正如依据该试剂的带电部 分所揭示的那样，它会进入细胞中。转化酶会攻击它，将它转化为有活性的药物。他的想象也有望让因试剂运送到体内其他部分可能产生的有害副作用最小化。仅有 肝细胞拥有天然的将这种化合物捕获到内部的代谢能力。

经过大量的调整和验证，Sofia设计出一种候选化学物在这种复制子系统中表现良好，而且通过其他的测试。早期的临床试验表 现出非常有希望的结果，而且吉利德科学公司在2012年早些时候收购了Pharmasset公司。在2013年1月，Pharmasset公司团队、吉利 德科学公司和来自新西兰的临床合作人员发布了这些引人注目的发现。通过与利巴韦林组合使用，作为一种毒性的但是不是基于干扰素的抗病毒试剂，这种被称作索 非布韦（sofosbuvir）的新药物会长期地根除HCV。在感染上一些HCV基因型的病人当中，在为期12周的治疗期限结束24周后还不能够检测到这 种病毒的存在。在这种治疗方案中干扰素的缺乏开启治愈性HCV疗法的新纪元。

在2013年12月6日，一种索非布韦治疗方案被美国FDA批准用于治疗一些HCV基因型感染。最终，患有慢性HCV感染的病人有了一种不含干扰素的疗法。随后，经证实索非布韦在不同的病人群体和不同HCV基因型中都是有疗效的。

与此同时，这种复制子测定已在促进其他的科学家们发现新的药物。由Min Gao领导的一百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb）团队鉴定出一种靶向一种具有未知功能的HCV蛋白的化合物。这一成就展示了这种复制子系统的另一个优势---不论科学们是否理解它的基础， 它能够让这种细胞揭示出是什么在HCV复制中起着重要作用。

吉利德科学公司快速地开发出由Gao和同事们开创性开发出的这种化合物的一种衍生物。组合使用吉利德科学公司开发的这种新试剂雷迪帕韦 （ledipasvir）和索非布韦快速地抑制这种病毒。这种治疗方案自夸仅需8到12周的治疗就可达到94%～99%的治愈率，即便是在难以治疗病人当 中。这种雷迪帕韦/索非布韦组合如今被FDA批准用来治疗多种类型的HCV感染，包括美国和欧洲最为常见的HCV感染类型。它是首个避免使用干扰素和利巴韦林的HCV疗法。从那以后，4种其他的类似药物已被批准使用。索非布韦作为其中的2种药物的骨架，而另外两种药物则是基于不同的化合物。

当Bartenschlager、Rice和Sofia针对他们面临的生物学障碍和化学障碍设计出创新性的方法时，他们克服了多种障碍。他们取得的成功最 终导致人们开发出一种安全的有效的口服HCV药物，从而为治疗一种灾难性的疾病设置一种新的标准和引发变革。（生物谷 Bioon.com）

1. Ralf F.W. Bartenschlager的关键性发表物

Lohmann, V., Körner, F., Koch, J.O., Herian, U., Theilmann, L., and Bartenschlager, R. (1999).Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.Science. 285, 110-113.

Bartenschlager, R. and Lohmann, V. (2000).Replication of hepatitis C virus. J. Gen. Virol. 81, 1631-1648.

Krieger, N., Lohmann, V., and Bartenschlager, R. (2001).Enhancement of hepatitis C virus RNA replication by cell culture-adaptive mutations. J. Virol. 75, 4614-4624.

Wakita, T., Pietschmann, T., Kato, T., Date, T., Miyamoto, M., Zhao, Z., Murthy, K., Habermann, A., Kräusslich, H.-G., Mizokami, M., Bartenschlager, R., and Liang, T.J. (2005). Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796.

Pietschmann, T., Kaul, A., Koutsoudakis, G., Shavinskaya, A., Kallis, S., Steinmann, E., Abid, K., Negro, F., Dreux, M., Cosset, F.L., and Bartenschlager, R. (2006). Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 7408-7413.

2. Charles M. Rice的关键性发表物

Grakoui, A., Lin, C., Wychowski, C., Feinstone, S., and Rice, C.M. (1993).Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. J. Virol. 67, 1385-1395.

Kolykhalov, A.A., Feinstone, S.M., and Rice, C.M. (1996).Identification of a highly conserved sequence element at the 3' terminus of hepatitis C virus genome RNA. J. Virol. 70, 3363-3371.

Kolykhalov, A.A., Agapov, E.V., Blight, K.J., Mihalik, K., Feinstone, S.M., and Rice, C.M. (1997). Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277, 570-574.

Blight, K.J., Kolykhalov, A.A., and Rice, C.M. (2000).Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.Science. 290, 1972-1974.

Lindenbach, B.D., Evans, M.J., Syder, A.J., Wölk, B., Tellinghuisen, T.L., Liu, C.C., Maruyama, T., Hynes, R.O., Burton, D.R., McKeating, J.A., and Rice, C.M. (2005). Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626.

3. Michael J. Sofia的关键性发表物

Sofia, M.J., Bao, D., Chang, W., Du, J., Nagarathnam, D., Rachakonda, S., Reddy, P.G., Ross, B.S., Wang, P., Zhang, H.R., Bansal, S., Espiritu, C., Keilman, M., Lam, A.M., Steuer, H.M., Niu, C., Otto, M.J., and Furman, P.A. (2010). Discovery of a β-ᴅ-2'-deoxy-2'-α-fluoro-2'-β-C-methyluridine nucleotide prodrug (PSI-7977) for the treatment of hepatitis C virus. J. Med. Chem. 53, 7202-7218.

Sofia, M.J., Furman, P.A., and Symonds, W.T. (2010). 2'-F-2'-C-methyl nucleosides and nucleotides for the treatment of hepatitis C virus: from discovery to the clinic. In: Accounts in Drug Discovery: Case Studies in Medicinal Chemistry. Chapter 11. Royal Society of Chemistry, London, pp. 238-266.

Sofia, M.J. (2013). Nucleotide prodrugs for the treatment of HCV infection. Adv. Pharmacol. 67, 39-73.

Sofia, M.J. (2014). Beyond sofosbuvir: what opportunity exists for a better nucleoside/nucleotide to treat hepatitis C? Antiviral Res. 107, 119-124.

Sofia, M.J. (2015). Sofosbuvir: a breakthrough curative therapy for the treatment of HCV infection. In: Medicinal Chemistry Reviews. Vol. 50. Med. Chem. Div., Am. Chem. Soc., Foster City, CA. pp. 397-416.

4. 针对丙型肝炎治疗药物的期刊编者评论

Hoofnagle, J.H. and Sherker, A.H. (2014).Therapy for Hepatitis C - the costs of success. New Engl. J. Med. 370, 1552-1553.

Liang, T.J. and Ghany, M.G. (2014). Therapy of Hepatitis C - back to the future. New Engl. J. Med. 370, 2043-2047.