法尼醇受体激动剂LJN452开发：构象限制策略应用实例

 1995年，美国两个独立的研究团队同时发现了一个新型核受体，能够微弱的被甲戊二羧酸途径的中间体法尼醇所激活，因而取名为“法尼醇受体(FarnesoidX receptor，简称FXR)”。后续的研究发现，法尼醇受体在肝脏、胆囊、肠道以及肾脏中高度表达，而且确认了鹅去氧胆酸(CDCA)才是其真正的内源性配体，随后，法尼醇受体的信号通路逐渐被揭示出来，并证明了其在肝脏代谢调节中的重要作用。

图一  法尼醇受体信号通路

在肝脏中，FXR主要调控胆汁酸的合成、转运以及糖、脂代谢相关基因的表达。对胆汁酸的调节作用主要表现在：肠道中被重吸收后的胆汁酸激活FXR，引起胆汁酸结合蛋白以及FGF19(纤维母细胞生长因子)表达水平的升高，FGF19分泌进入门静脉循环，随后在肝脏中与FGFR4受体结合，活化MAPK信号通路，进而引起CYP7A1(胆固醇7α羟化酶，是中性胆汁酸生物合成中的关键限速酶)表达的下调，以及通过诱导SHP(小异源二聚体伴侣分子)下调CYP7A1的表达，通过这两条途径，活化FXR可减少胆汁酸的合成。同时，FXR还可以调节胆汁酸解毒相关酶的表达，从而促进胆汁酸的泌出，抑制胆汁酸的合成和肝细胞对其的再吸收。另外，活化FXR还能抑制脂肪再生酶系的关键转录因子(SREBP-1c)的活性，进而达到调控甘油三酯代谢以及脂肪再生的作用。

基于上述的研究结论，FXR是一个潜在的肝病和脂肪代谢作用靶点，如胆汁淤积相关疾病和非酒精性脂肪肝炎(NASH)。胆汁淤积相关肝病是由胆汁淤积造成的肝损伤，此类疾病发病率较低，NASH是非常常见的一种慢性肝病，发病率较高，很容易诱发肝硬化以及肝癌，而且目前没有针对该病的特效药，患者只能通过饮食控制、减肥来缓解病症。

图二  FXR激动剂

鉴于FXR显著的生理调节作用，很多制药巨头参与到了FXR激动剂的开发中，如礼来、GSK、诺华等。奥贝胆酸是第一个上市的FXR激动剂，由美国Intercept公司开发，属于胆汁酸类似物，于2016年5月31日获得FDA批准上市，适应症为原发性胆汁性胆管炎。另外，针对NASH适应症的临床研究目前已推进至三期。奥贝胆酸的上市证明了FXR在肝病领域的巨大潜力，然而该药并不理想，瘙痒反应明显，个别患者还出现了较为严重的心血管事件，除此之外，还会导致血脂指标的紊乱以及心血管疾病的风险提高，如动脉粥样硬化等，如此大大限制了奥贝胆酸的临床应用，因此开发具有选择性的FXR激动剂，就成了目前最具前景的方向。

图三  异恶唑类非甾体FXR激动剂

2000年，GSK通过对样本为9000的化合物库进行筛选，通过非细胞-结合敏感性测试，得到非胆汁酸异噁唑类FXR激动剂GW4064。该化合物体外测试表现优异，然而PK数据太差(高清除率和低生物利用度)以及潜在的毒性和光不稳定性，主要是结构中的二苯乙烯结构造成的，大大限制了其成药的可能性，因此，对二苯乙烯结构的优化就成为了第一个突破方向。

图四  GW4064的初步优化

二苯乙烯结构的构象刚性是实现激动作用的关键。它在溶液中仅存在两种主要的构象，如果还原掉双键后，自由度大大增加，会降低其对FXR受体的转录激动作用，因此在对二苯乙烯结构进行优化时，要充分保证其构象刚性，因为如果分子的构象数目众多，就会导致分子难于以正确的构象与靶分子结合，引起分子-靶点亲和力的下降，对于可旋转键数目在五个或者五个以上的化合物，其晶体结构并不能代表其与蛋白结合的真实构象，此外，同一个药物的不同构象可能会与不同的靶点分子相结合，导致选择性降低，引起毒性和不良反应。对分子进行构象限制的方式有很多种，如柔性键可通过成环固定，柔性链可以通过引入双键、三键、酰胺、芳环等刚性官能团进行构象限制，还可以通过立体位阻方式进行构象限制。

为了简化合成难度，四个去氯含萘化合物A-D被制备出来，其中A、B分别模拟了GW4064在溶液中的两种构象，C、D则是为了探究GW4064中的羧基取代位置是否为最优位置。从上述数据可以看出，刚性保持的设计思路是合理的，A为全激动剂且活性和GW4064相近。A、B、C、D四个化合物中，A(GSK8062)的活性最好，证明了GW4064中羧基的取向是合理的。

GSK8062在体外测试中表现良好，活性与GW4064相近，但光稳定性大大提高，在狗和猴子的实验中，口服生物利用度良好，耐受性在可接受的范围，该化合物存在的主要问题是中性溶液中溶解性差，其次，在大鼠的实验中，口服暴露量有限，主要是高的清除率造成。再次，该化合物很难制备得到一个合适的结晶盐，后续的优化除进一步提高效能外，还需要解决溶解性以及成盐性问题。

图五 萘环杂环化

针对上述问题，将萘环氮杂化是一个理想的优化策略。如图五所示，将GSK8062的萘环进行不同位置的氮杂设计，其中化合物A1和化合物A4表现出和GSK8062相近的活性，A1为全激动剂，而A4为部分激动剂，细胞测试显示两者的活性相近(A1，EC50=50 nm；A4，EC50=77 nm)，在比格犬、大鼠、小鼠、食蟹猴四种动物上进行的试验显示，化合物A1表现出更好的生物利用度和更高的口服给药后曲线下面积(AUC)，因此，选择化合物A1作为阶段性的优化成果，进行更进一步的优化(GSK2324)。

图六  羧基部分的杂环化取代

虽然相比GSK8062，GSK2324的PK有了很大的改善，但是活性并未得到多少提高，从配体-受体蛋白共结晶X光衍射分析，羧酸部分与受体蛋白结合的调整仍然具有较大的优化空间，因此，将GSK2324中萘环部分采用一系列含羧基杂环取代，以期实现更好的活性(图六)。化合物B3和化合物B4的活性相比GSK2324提高了四倍多，比较有意思的是化合物B4和化合物B11相比，结构上仅仅是羧基取代位置的差异，而活性却相差30倍之多，且B4为全激动剂，而B11仅为部分激动剂，由于种种原因，GSK中断了此系列化合物的进一步研发，不过这些发现，为后续异恶唑类FXR激动剂的研发提供了宝贵的经验。

图七  EliLilly异恶唑类FXR抑制剂

Eli Lilly在GW4064以及其他相关研究的基础上，开发出了含哌啶环的异恶唑类FXR激动剂LY2562175，相比GW4064，其体外活性提高了一倍，但是效能仅有40%，为部分激动剂，它的结构与上述提及的化合物B4有很大的相似性，唯一比较大的差别是中间的苯环被哌啶环取代，导致分子的构象自由度增加，效能降低也在预料之中。至于为什么Eli Lilly没有继续保留SP2连接键，并未见相关报道，但可以推测，应该是为了提高成药性而做出的优化。

图八  Novartis苯并噻吩全激动剂

Novartis在进行此类FXR激动的优化时，保留了LY2562175中的哌啶环，将先前的甲基吲哚替换为苯并噻吩，得到一个全激动剂C1(图七)，其活性相比GW4064提高了一倍多，而且也解决了LY2562175部分激动的问题，但是C1的血浆清除率较高且口服生物利用率极低(6%)，在肝微粒体的代谢研究中，发现2,6-二氯苯是导致上述问题的关键，主要是因为该部分结构优良亲脂性，通常亲脂性优异的化合物更容易与体内的代谢酶系发生作用，引起严重的首过效应。

图九  2,6-二氯苯优化

在亲脂性和代谢稳定优化中，氟取代是常用的方式，保留C1中的苯并噻吩结构，将2,6-二氯苯的氯原子进行氟取代，得到的三个化合物(图八)中，C2和C3活性降低比较明显，且代谢稳定性并未得到明显的提高。C4活性降低了约一倍，但代谢稳定性得到了相当明显的改善，口服生物利用度37%，血浆清除率24mL/min/kg。

图十  活性优化

在改善代谢稳定性后，C4相对于GW4064活性相似，将哌啶环部分用氮杂吖丁环或吡咯环取代后，导致活性明显降低，而消旋的八元氮杂环取代(C6)活性虽然得到了提高，但代谢稳定性较差，不利于成药。采用莨菪烷取代后(C7)，发现活性极大的提高，可能是因为莨菪烷的桥环结构能够最大限度的保持分子的构象刚性，这也是先前众多药物化学家在进行此类化合物优化时采用的策略。后续的核受体选择性测试和PK试验中，C7表现优异，是一个非常理想的异恶唑类FXR激动剂备选药物。

目前化合物C7(LJN452)已推进至临床二期研究，主要针对胆汁淤积性肝病和非酒精性脂肪肝。2016年，Novartis发布了LJN452的首次临床数据，结果喜人，总共有95名受试者参加了这项研究，接受至少一次剂量的LJN452或匹配的安慰剂，其药代动力学适合每日一次给药，剂量依赖的药效关系显著！在健康受试者中，LJN452在高达3mg的单剂量下安全性和耐受性表现良好，未观察到药物相关的不良反应，多次给药后未发现药物引起的相关瘙痒反应出现，个别受试者出现ALT(谷丙转氨酶)/AST(谷草转氨酶)的升高，但并不造成临床后遗症，从目前一期临床数据来看，表现还不错，但是具体的情况还要等到后续二期临床的数据，LJN452能否脱颖而出成为下一个FXR激动剂，还需要用事实说话！

本文简要介绍了FXR激动剂LJN452的开发历程，以及分子构象刚性设计策略在其开发中的应用，从最初的先导化合物GW4064到后来的备选药物LJN452，可谓是一路波折，其中所传递出的设计思路，值得我们学习，同时也希望LJN452在后续的临床试验中顺利，毕竟肝脏相关疾病的可用药物确实相对较少，尤其是非酒精性脂肪肝病！

参考资料

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