【2014诺贝尔化学奖解读】突破极限，见所未见

2014年诺贝尔化学奖给了三个物理学家：艾力克·贝齐格（Eric Betzig）、斯特凡·W·赫尔（Stefan W. Hell）和W·E·莫纳（W. E. Moerner），以表彰他们对于发展超分辨率荧光显微镜做出的卓越贡献。他们的突破性工作使光学显微技术进入了纳米尺度，从而使科学家们能够观察到活细胞中不同分子在纳米尺度上的运动。

这三位获奖科学家都是业内大牛，很有知名度。贝齐格是美国应用物理学家和发明家，目前在美国霍华德·休斯医学研究所珍利亚农场研究园区工作；赫尔是罗马尼亚出生的德国物理学家，现在担任德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所所长；莫纳则是美国单分子光谱和荧光光谱领域的著名专家，从1998年至今一直在斯坦福大学担任教授。

2014 年诺贝尔化学奖得主：（左）艾力克·贝齐格（Eric Betzig），（中）斯特凡·W·赫尔 （Stefan W. Hell），（右）W·E·莫纳（W. E. Moerner）。图片来源：从左至右：janelia.org, wikipedia, wikipedia

这三大牛中，贝齐格是一个极具个性的人。20世纪90年代初，贝齐格加入贝尔实验室，研究一种非常特殊的显微镜（叫近场显微镜）。贝尔实验室是个高手云集的地方，已经出了好几个诺贝尔奖得主。但是，贝齐格在贝尔实验室做了几年、发了好几篇好文章、得了好几个奖之后就觉得在学术界没意思，于是乎毅然决然地离开了贝尔实验室。去哪儿呢？这里不得不说一下，贝齐格其实是个土豪，是个富二代。他离开贝尔之后就去他爸开的公司 了。是金子到哪儿都闪发光，在公司上班的几年间，贝齐格又搞出了好几个发明和专利。赚了大把的钱之后，贝齐格觉得在工业界待“累了”，又想回学术界——但这个时候，他已经离开学术界七年，想回来谈何容易？

怎么办？牛人说：没事，我先在家捣鼓捣鼓。就这样，贝齐格在自己家客厅捣鼓出了一个超分辨率荧光显微镜（PALM，见下），最终导致他夺得今年的诺贝尔化学奖。不过故事到这里还没有结束：捣鼓完这个超分辨率显微镜没几年，贝齐格又觉得自己的这个技术没太多意思，便转到另外一个方向，开始引领另一个潮流（选择性光片照明显微镜，这几年刚火起来的一个领域）。另外一个有意思的事情是，今年八月在德国的一个学术会议 上，有人问贝齐格关于诺贝尔奖的事，大牛撇撇嘴傲娇地回答道：诺贝尔奖没意思，做有趣的科研才是正事。

光学显微镜及其分辨率限制

为什么说这三位获奖者的工作是突破性的呢？

故事得从光学显微镜说起。随着黑暗的中世纪时代结束，欧洲进入文艺复兴时期。在文化艺术得到极大发展的同时，现代自然科学也慢慢发展起来：第一台光学显微镜正是在文艺复兴时期问世。是谁制造了第一台光学显微镜已不完全可考（一说是两个荷兰的眼镜制造商于16世纪晚期发明），但这不重要。重要的是，从此以后科学家们可以用光学显微镜来瞧瞧这个瞅瞅那个了，观察的对象当然也包括各种生命有机体。在那个时代，随便看看树叶小草也是个重量级的大发现：著名的罗伯特·胡克（Robert Hooke）先生就是在1665年用光学显微镜看了看红酒瓶的软木塞从而发现了细胞的存在。现代生物学及微生物学皆因光学显微镜而诞生，光学显微镜也成为生命科学中必不可少的工具。随着人们观测的东西越来越小，人们不禁疑问，光学显微镜到底能看多小？

“能看多小”换成比较科学的说法就是“分辨率有多高”。分辨率（严格讲是光学分辨率）描述的是成像系统解析成像细节能力，或者说是成像系统能区分的两点之间的最小距离。1873年，物理学家恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）得出结论：传统的光学显微镜分辨率有一个物理极限，即所用光波波长的一半（大概是0.2微米，即200纳米）。

为什么会这样呢？要理解这个，我们回到高中物理曾经介绍过的单缝衍射实验：当一束光经过一条狭缝，在中间亮条纹的两侧会出现一系列明暗交替的条纹。这是因为光是电磁波，它被狭缝限制时会发生衍射从而偏离直线传播。如果光经过的不是一条狭缝，而是一个圆孔，那么圆孔会在各个方向上限制光的传播，从而光在各个方向上发生衍射而形成圆孔衍射图样，或者叫“爱里斑”（Airy Disk）：这个图案中心有一个比较大的亮斑，外围有一些 明暗交替的环。同样的道理，由于衍射的存在，成像系统无法把光线汇聚成无限小的点，而只会在像平面上形成有限大小的爱里斑。通过任何光学仪器成像的过程，都可以认为是把物平面上的无数微小的点转换成爱里斑，然后再把它们叠加起来呈现在像平面上。这样的结果是，任何成像系统所得到的像无法精确地描述物体的所有细节。

那么像平面上能够呈现多精细的细节？假如物平面上有两个点，通过一个光学成像系统后产生两个爱里斑。当这两个点离得较远时，像平面上的爱里斑也会离得较远——此时我们可以轻松分辨出物平面上有两个点。如果把两个点逐渐移近，爱里斑也会随之接近。当它们接近到一个圆斑中心与另一个圆斑边缘重合的时候，我们达到能够分辨出有两个点的极限（这就叫瑞利判据）。如果这两个点更接近，像平面上的两个爱里斑就几乎重合在一起，成为一个圆斑，那物平面上的两个点就不可分辨了。因此，爱里斑的直径就给出了理想光学系统的最高分辨率；在光学显微镜中，这个数值大概是光波波长的小一半，0.2微米或200纳米。

（A），（B）爱里斑；（C）分辨率及瑞利判据。图片来源：wikipedia.org。

很长时间以来，人们都认为光学显微技术无法突破这个极限。为了达到更高的分辨率，很多人选择了其他显微技术，如电子显微镜（分辨率能达到0.2纳米）。事实上，电子显微镜也是遵循衍射规律的。不同的是电子波长比光波短1000倍，从而分辨率更高。然而，电子显微镜有一个很明显的缺点：它很难用于活体生物样品的观察；相反地，光学显微镜对于观察的样品基本没有侵略性。

超分辨率荧光显微镜的原理

这三位科学家是如何突破光学显微镜的分辨率极限呢？

首先登场的是莫纳。超分辨率荧光显微镜很重要的一个方面是荧光。荧光是一种光致冷发光现象。荧光分子能够吸收一种波长的光，放射出另外一种波长的光。荧光分子是有一定寿命的，其持续发光一段时间后，将不能继续发光（这种现象叫做光致褪色）。荧光分子可以是荧光蛋白质分子（如2008年诺贝尔化学奖得主钱永健发现的绿色荧光蛋白），也可以是有机分子。在莫纳之前，人们观测荧光分子时都是同时观测到几百万几千万个分子，得到的结果是其平均统计结果。而莫纳是第一个能够探测单个荧光分子的人，于1989年将技术推进到观测单个荧光分子。能够探测并观察单个荧光分子对于超分辨率显微镜极其重要。虽然单个荧光分子成像后也是一个0.2 微米的爱里班，但是在没有其他分子存在的情况下，它的中心位置可以更精确地被确定下来的。这就好比一座山峰直径很大，但是峰顶的位置却能轻松的测量。在一定条件下，单个荧光分子的定位精度能达到1纳米。这是超分辨率显微镜的基础。

莫纳的另一个贡献是发现了像控制电灯泡一样方便地控制荧光蛋白发光的方法：一些已褪色的荧光蛋白在照射 405nm激光后能够被激活，再照射其激发光（如488nm）即可重新发出荧光；这个方法称为“光激活（photoactivation）”。

光激活定位显微镜原理。图片来源：修改自 2014 年诺贝尔化学奖报告。

贝齐格发明的超分辨率显微镜叫光激活定位显微镜（photoactivated localization microscopy，PALM），其中所利用的就是莫纳发现的光激活方法。贝齐格利用微量的405nm激光照射样品，使得其中极小部分荧光分子能够发出荧光。由于这些发光的荧光分子很稀疏从而相距较远，它们的位置能够精确地确定下来。等这些分子光致褪色后，再次照射405nm激光而激活另一小部分荧光分子。重复这个过程即可将样品中的所有分子定位出来，从而得到整个样品的图像。

溶酶体膜在不同显微镜下的成像结果。（左）传统光学显微镜成像；（中）光激活定位显微镜成像；（右）放大的光激活定位显微镜成像。注：0.2 微米刻度相当于阿贝衍射极限，分辨率得到很大改善。图片来源： Science 313：1642–1645。

赫尔则另辟蹊径，他发明的是STED（受激发射损耗，stimulated emission depletion）荧光成像技术。在这个技术中，虽然激发光脉冲能够激发0.2微米区域内的所有荧光分子，但是另一种甜甜圈形状的激光能将其照射区域的所有分子的荧光消除，从而只留下中间的分子的荧光。通过扫描整个样品，从而实现对整个样品的成像。

STED显微镜原理。图片来源：修改自2014年诺贝尔化学奖报告。

另一片天空

今天，科学家们能够从最微小的分子细节来研究活细胞，这在前人看来是不可能的事情。在纳米显微 （nanoscopy）领域，科学家可以观察到更小的结构，也可以观测活细胞中不同分子的运动—— 他们能够看到脑部神经细胞间的突触是如何形成的，他们能够观察到与帕金森氏症、阿尔兹海默症和亨丁顿舞蹈症相关的蛋白聚集过程，他们也能够在受精卵分裂形 成胚胎时追踪不同的蛋白质。这无疑将推动人类从分子水平理解生命科学中的现象与机理。

华人科学家庄小威的工作

值得一提的是，几乎与贝齐格2006年发明PALM同时，哈佛大学化学系与物理系的华人教授庄小威也独立发明了另一种超分辨率显微镜（STORM，stochastic optical reconstruction microscopy）。PALM和STORM这两种显微技术不仅同年，而且原理也基本一致。不同之处在于贝齐格利用的是光激活蛋白，而庄小威使用的是有机荧光分子对。但很遗憾的是，庄小威并未能分享今年的诺贝尔化学奖。（编辑：Calo）