高通量自动化反应筛选的“军备竞赛”

发现先导化合物是药物研发的重要环节，传统的化学合成、分离、结构鉴定、活性筛选模式存在诸多不足，例如目标不明确、耗时长、工作量大、成本高、操作繁琐等等。近年来，随着自动化技术的发展以及各种分子细胞水平药物活性评价方法的出现，新药研发中出现了高通量筛选（high-throughput screening）技术，大大加快了候选化合物的活性筛选速度，同时这一筛选技术的出现也导致待测化学样品的需求量迅猛增长，并促进高通量合成（high-throughput synthesis）技术的发展。目前，基于分子片段的药物发现策略是新药研发的常用方法，通过不同小分子片段连接、合并等方式构建起小分子化合物库，可以弥补传统化合物库筛选所面临的盲目性大、命中率低以及候选分子结构难以优化等问题。在这种策略中，候选化合物的高通量合成主要依赖于过渡金属催化小分子片段间的偶联和酰胺化等有机反应，而高通量活性筛选则广泛使用基于小分子化合物与靶标蛋白的亲和筛选技术。尽管如此，从高通量偶联合成到高通量活性筛选过程仍需经历候选化合物产率优化、毫克量级制备、分离纯化等漫长步骤，无疑增加了先导药物发现的时间和成本。

2015年1月，默沙东公司（在美国和加拿大称“默克”，此外的其他国家和地区称“默沙东”）的Tim Cernak等研究人员报道了一种自动化高通量化学反应筛选平台（Science, 2015, 347, 49-53）。该平台以微孔板为反应载体，以液相色谱-质谱联用采集实验数据，通过自动化操作系统执行整个实验过程，可以极高效率完成纳摩尔量级的C-C、C-O、C-N键偶联反应组合和反应条件的筛选，每天运行1536个反应，并能在线处理实验数据。3年之后，另一个制药巨头辉瑞也推出了自己的自动化高通量反应筛选平台（Science, 2018, 359, 429-434）。该平台采用的策略基于近些年火热的流动化学技术，通过与超高效液相色谱-质谱联用相结合，可在1天内筛选超过1500多个纳摩尔量级的Suzuki-Miyaura偶联反应。与3年前Tim Cernak等人的技术相比，辉瑞的平台进步明显，不但可以在不同溶剂、温度、压力等条件下进行反应，还支持数百微摩尔量级的合成以满足后续生物活性测试的需求。

辉瑞的自动化高通量化学反应筛选平台照片。图片来源：Science

辉瑞的文章发表之后仅3个月，默沙东的Tim Cernak等人就在Nature 上发表文章，对他们之前报道的自动化高通量反应筛选平台进行了“大规模”升级，增加了一项重要功能——化合物生物活性测试。具体来说，在高通量的纳摩尔量级（每个反应消耗少于0.05毫克底物）偶联反应完成后，使用无需标记的亲和选择-质谱法（Affinity-selection mass spectrometry，ASMS）直接测定反应产物对靶标蛋白的亲和性，并进行排序，无需常规方法中极其耗时的纯化步骤，也避免了大量无亲和活性候选化合物的合成、分离等工作。他们将这种高通量纳摩尔量级合成和亲和性筛选排序一体化的新技术命名为NanoSAR（Nanoscale synthesis and affinity ranking）。结果表明，该技术可帮助他们快速地从3114个纳摩尔量级的偶联反应中筛选出可抑制靶标蛋白激酶CHK1的产物及其合成条件，大大加快了先导药物发现的速度，降低了稀缺原料的用量。并且，NanoSAR技术所发现的一些具有潜在活性的化合物，用常规手段完全无法发现。

高通量纳摩尔量级的合成与亲和性筛选排序一体化技术。图片来源：Nature

将化学合成与生物活性测试结合起来不算是新想法。不过，当前的大多数策略中，要么生物活性测试不支持高通量的偶联反应，要么需要在生物活性测试之前对高通量偶联合成的产物进行纯化、预处理等复杂耗时的操作。NanoSAR技术最重要的突破，就是对高通量纳摩尔量级偶联反应完成后的产物混合物进行直接的亲和性筛选。如下图所示，NanoSAR技术第一步（a-c），通过自动化高通量反应平台对大量底物的组合及反应条件进行筛选，并通过超高效液相色谱-质谱联用装置在线检测每个偶联反应的产物及产率。第二步（d-g），将所有生成的小分子产物混合并与体外纯化的靶标蛋白进行孵育反应，通过体积排阻色谱柱（size exclusion column）分离出小分子产物（作为配体）与靶标蛋白结合的复合物，分离出的复合物再经变性解离以释放小分子配体，然后对这些小分子配体再进行质谱分析便可获得其结构信息。需要指出的是，当靶标蛋白含量逐渐降低时，混合物中小分子配体之间将会产生竞争，亲和性高的小分子将优先与靶标蛋白结合。通过这种方法，对比不同浓度靶标蛋白与小分子配体作用后的质谱结果的变化，便可以间接辨别不同亲和性的小分子配体并对其亲和性进行排序。第三步（h, i），根据亲和性排序选择目标分子，按照最佳的反应条件对目标分子进行毫克量级的制备和纯化，然后进行常规生物活性测试，如对靶标蛋白的抑制活性K_i或IC₅₀。

NanoSAR技术的流程图。图片来源：Nature

为了验证NanoSAR技术的可行性，研究人员选择了三种蛋白激酶（ERK2、MK2、CHK1）的多种抑制剂进行实际检验。结果表明，NanoSAR技术给出的亲和性排序，与常规合成、纯化、生物活性测试得到的结果高度一致。以MK2为例，针对18种MK2抑制剂，在自动化高通量反应平台下，他们以化合物4为模板底物，对18种偶联底物组合在8种不同反应条件下进行144个纳摩尔量级的Suzuki偶联反应，其中化合物4的消耗仅为5.1毫克。随后利用ASMS技术从与不同浓度MK2（0.3-4.8 μM）作用后的产物混合物中识别出不同亲和性的小分子化合物并排序。根据从纳摩尔量级反应中筛选出的最佳反应条件，他们又对18种抑制剂进行了毫克量级的制备，分离纯化后进一步测试其生物活性。结果显示NanoSAR筛选出的亲和性高的产物往往具有较强的MK2抑制活性，而亲和性低的产物往往MK2抑制活性较差。这表明NanoSAR技术确实能够通过亲和性排序有效区分不同生物活性的小分子化合物。

使用已知的靶标蛋白抑制剂检验NanoSAR技术的可行性。图片来源：Nature

验证过了之后就是实战。NanoSAR技术可以高通量快速筛选反应条件、合成砌块以及产物与靶标蛋白的亲和性，使得研究人员可以用它来进行以前无法实现或不可能实现的探索。他们以激酶CHK1为靶标蛋白，尝试发现此前未知的小分子抑制剂。首先，通过自动化高通量反应平台对溴代杂环化合物7与17种代表性合成砌块间在不同反应条件下（催化剂、碱、溶剂）的上千个偶联反应进行了初步筛选，针对每类砌块确定出了最佳的四组反应条件。他们接着使用上述四组反应条件，从化合物7与384种不同的合成砌块（包括48种硫醇、64种醇、32种炔烃、80种硼酸、32种酰胺、32种磺酰胺和96种胺）间的1536个C-N、C-O、C-S、C-C键偶联反应中获得345种候选产物。随后，345种粗产物的混合物与不同浓度的靶标蛋白CHK1（0.2-10 μM）作用后，通过ASMS可快速识别这些候选产物与CHK1亲和性的高低，并进行排序。结果表明，大多数硫醇、醇、炔烃、磺酰胺类产物对CHK1基本无亲和活性，而具有亲和活性的分子主要为硼酸、胺、酰胺类产物。根据所得最佳的反应条件及亲和性筛选排序结果，研究人员对部分小分子产物进行了毫克量级规模的制备、纯化和生物活性测试。结果表明，具有高亲和性的产物分子展现出较强的CHK1抑制作用，而无或弱亲和性的分子CHK1抑制作用也较差。

NanoSAR技术高通量筛选CHK1抑制剂及其合成条件。图片来源：Nature

部分化合物的亲和性与生物活性（IC₅₀）。图片来源：Nature

利用NanoSAR技术，实验人员无需分离产物，快速地进行了3114个偶联反应，仅仅消耗了123 mg的原料（7），就筛选了多个反应条件组合和384种不同的合成砌块，得到了345种候选产物及其合成条件（下图b，黄圈代表反应成功，紫叉代表反应失败），并且得到了产物与靶标蛋白的亲和性排序。相比之下，按照常规方法筛选384种不同的合成砌块，仅仅获得了158种可检测的产物（下图a），比NanoSAR技术少187种，而且优化的合成条件也没有拿到，差距显而易见。在常规方法无法触及的187种产物中，NanoSAR技术预测其中21种是潜在的活性化合物并且给出了合成条件。后续的合成、纯化和生物活性测试结果也验证了这一点——这21种化合物中，有一些（例如化合物42–45）抑制CHK1的IC₅₀在nM量级，活性很高（下图c）。也就是说，常规方法无法发现的潜在药物小分子，在NanoSAR技术里就不会被埋没。

NanoSAR技术与常规技术的对比。图片来源：Nature

——总结——

默沙东公司的这项研究为药物发现提供了强大的工具，结合自动化高通量纳摩尔量级化学反应与亲和选择-质谱法，他们不仅可以用最少的原料、在最短的时间内评估数千个纳摩尔量级的反应，筛选反应底物和反应条件，并且无需分离纯化就能够对大量产物混合物进行靶标蛋白亲和性筛选和排序，以预测这些产物的生物活性，并且由此指导后续的合成、纯化、生物活性测试等等工作。毫无疑问，将高通量反应筛选与亲和性筛选整合起来的NanoSAR技术，可帮助药物化学家避免大量无生物活性化合物的合成和分离纯化工作，更全面和更快速地筛选化合物，由此找出最具潜力的目标，提高药物发现的“命中率”。

同为顶尖的制药公司，默沙东和辉瑞免不了有些竞争。不过这种药物发现领域中关于新方法、新设备的“军备竞赛”应该是大家愿意看到的。更多药物开发出来，就会有更多患者获益。笔者内心颇有些期待，辉瑞下一次会带来什么样的创新呢？

Nanoscale synthesis and affinity ranking

Nature, 2018, 557, 228–232, DOI: 10.1038/s41586-018-0056-8