关于强制降解试验的决策树

降解试验目的

“Stability testing of New Drug Substances and Products” ICH Q1A (R2)要求，原料药需进行强制降解试验以阐明其结构的稳定性，同时有助于识别其可能产生的降解产物。2015年，CFDA发布的《化学药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则(修订)》中指出，原料药的稳定性研究需进行影响因素试验，即“通过给予原料药较为剧烈的试验条件，如高温、高湿、光照、酸、碱、氧化等，考察其在相应条件下的降解情况，以了解试验原料药对光、湿、热、酸、碱、氧化等的敏感性、可能的降解途径及产生的降解产物，并为包装材料的选择提供参考信息。”

下面是ANDAs中的部分关于强制降解试验的缺陷：

a. Your drug substance does not show any degradation under any of the stress conditions. Please repeat stress studies to obtain adequate degradation. If degradation is not achievable, please provide your rationale.

b. Please note that the conditions employed for stress study are too harsh and that most of your drug substance has degraded. Please repeat your stress studies using milder conditions or shorter exposure time to generate relevant degradation products.

c. It is noted that you have analyzed your stressed samples as per the assay method conditions. For the related substances method to be stability indicating, the stressed samples should be analyzed using related substances method conditions.

d. Please state the attempts you have made to ensure that all the impurities including the degradation products of the unstressed and the stressed samples are captured by your analytical method.

e. Please provide a list summarizing the amount of degradation products (known and unknown) in your stressed samples.

f. Please verify the peak height requirement of your software for the peak purity determination.

g. Please explain the mass imbalance ofthe stressed samples.

h. Please identify the degradation products that are formed due to drug-excipient interactions.

i. Your photostability study shows that the drug product is very sensitive to light. Please explain how this is reflected in the analytical method, manufacturingprocess, product handling, etc.

强制降解实际情况

然而，指南中仅建议了温度(如50度、60度)、湿度(如75%RH或更高)、光(参见ICH Q1B)的降解试验条件，对于酸、碱、氧化试验没有做过多的描述。因此，在具体试验过程中，我们常常会有这样的困惑：

1)什么样的反应物能有助于降解试验？

2)在进行氧化降解时，什么样的氧化剂最佳？

3)进行酸降解时，能否使用硫酸代替盐酸？

4)如果前一次的降解试验没有得到足够的降解产物，那么，我们该采用什么极端的条件以获得足够用于分离鉴别的降解产物？

5)是否有这样或那样的条件，我们满足后就可停止或不需再进一步的试验？

酸降解

在进行酸降解时常用0.1N ~ 1.0N HCl，也有使用更浓的HCl；而除了使用盐酸外，也有使用不同浓度硫酸作为酸降解试剂。同时，不同酸降解的反应条件也是多种多样，反应温度从40度到110度，甚者采用回流或沸腾条件，反应时间也从1小时到2个月不等。有的药物，如奥美拉唑，选用0.5N的硫酸回流5min即完全降解，而头孢氨苄在同样条件下一点没有发生降解；有的药物在0.1N盐酸条件下回流1周也未发生降解。

碱降解

NaOH是常用的碱降解试剂，浓度从0.1N到1.0N不等，有时也使用KOH，但使用得比较少。与酸降解一样，对于碱降解的反应温度变化也很大，从30度到100度甚至沸腾或回流。由于不同分子内部结构的差异，有些分子在0.1N氢氧化钠条件下沸腾一周未发生降解，而有些分子如三氟拉嗪在0.1N氢氧化钠、30度温度下放置24小时即可发生完全降解。同理，当使用1N的NaOH时，有些分子如雷尼替丁，沸腾20min即可降解至84.4%，而诺氟沙星在100度下进行15小时也未发生降解。

氧破坏

在进行氧破坏的氧化剂中，常用的氧化剂为双氧水，浓度为1%到30%。有些药物比较容易发生氧降解，如盐酸雷尼替丁和盐酸西咪替丁，使用3%的浓度在室温下即可较快完成降解试验；而有的药物如盐酸舍曲林，在浓度为10%条件下回流6个小时也未发生一点的降解。这表明，有些药物是易被氧化的，而有的药物则不易被氧化，甚至使用更高浓度的氧化剂也不会氧化降解。

光降解

很多光降解试验表明，在进行光降解时，光降解条件也非一成不变的。根据药物特点，药物可暴露于长波长或短波长的紫外灯下，也可暴露于400-1580fc的日光灯下，试验温度一般为室温或接近室温，试验周期为几个小时到几个月不等，依赖于光源强度。盐酸西咪替丁在UV下进行几个月也未发生降解；维生素A酸在UV下2h即降解了一半。

决策树

药物分类

根据药物的稳定性情况，我们可以将它们分为六类：极不稳定、很不稳定、不稳定、稳定、非常稳定、极度稳定。

光降解中，根据ICH光降解条件将药物分为两类：对光敏感和对光不敏感，即如果药物在ICH推荐的光条件下(1.2*10⁶ lux h)能充分分解或完全降解，那么该药物为对光敏感类药物；否则，将总照度改为6.0*10⁶ lux h。

当我们拿到一个新药物时，我们一般首先将它默认为是第三类“不稳定”药物，然后根据反应结果来判断是否需要加大或弱化降解反应条件。

酸/碱降解

为了研究药物在酸/碱条件下的水解过程，我们可以先从0.1N HCl/NaOH回流8小时开始，认为药物是不稳定的，见下图决策树：

如果能够获得足够降解产物或者说能达到试验目的，那么就可不必再进行深究试验；如果药物没有发生降解，则可以增加酸/碱的浓度，同时增加反应时间；依次类推。如果药物在5N浓度下回流24小时(苛刻条件)还未发生降解，则该药物为“极度稳定”一类。另一方面，若药物在初始条件下即完全降解，那么，则应降低酸/碱浓度，同时降低反应温度；若浓度降低至0.01N、反应时间降低至2h、反应温度降低至25度(接近室温)，药物仍能充分降解，则该药物为“极不稳定”一类，需探索更温和的反应温度和反应pH值。

从上图的酸/碱降解决策树中可发现，推荐的起始降解条件为0.1N酸/碱，回流8小时；假如起始降解条件不满足降解要求，则恶化降解条件。不推荐直接采用恶化条件进行降解试验：1)直接采用更恶劣的降解条件，可能会改变药物降解的路径或反应机制；2)浓度过高的酸或碱对HPLC柱子有损伤。

在进行降解试验前了解一下药物分子的结构信息有时也是有帮助的，如，药物小分子上有一个酯基，酯基易于水解，那么我们可能使用低浓度的碱即可完成试验。

氧破坏

为了研究药物氧破坏的难易程度，我们可以先将药物放置于3% H2O2在室温下反应6小时作为起始条件，见下图决策树：

如果能够获得足够降解产物或者说能达到试验目的，那么就可不必再进行深究试验；如果药物没有发生降解，则可以先增加反应时间，由原来的6小时提高至24小时；如果药物仍未发生降解，则可以增加氧化剂浓度，由3%提高到10%；若还未降解，则氧化剂浓度可提高至30%；若药物在30%H2O2浓度下反应24小时仍不能发生降解，则该药物为“极度稳定”一类。另一方面，若药物在初始条件下即完全降解，那么，则应降低H2O2的浓度，从3%降低至1%，同时缩短反应时间；若氧化剂浓度降低至1%、反应时间降低至30min，药物仍能完全降解，则需探索更低氧化剂浓度和更短的反应时间。

金属离子有助于氧化反应的进行，是氧化反应的催化剂，因此，有时额外补加一点金属离子，氧降解反应会增加几千倍，如铜有助于将维生素C的氧降解提高1万倍。但并非所有的氧降解加金属离子均可以，有时加入金属离子会使原有的降解路线发生改变。

光降解

光降解与其它条件有所不同，药物的起始反应条件与ICH推荐的一致，即1.2*10⁶ lux h，若在此条件下未发生降解，则可将总照度提高至5倍，即6.0*10⁶ lux h；若此条件下药物仍未发生降解，则该药物为“对光不敏感”一类。

对于光降解试验，建议主要还是遵从ICH Q1B指南，可采用任何输出相似于D65/ID65发射标准的光源，如具有可见-紫外输出的人造日光荧光灯、氙灯或金属卤化物灯，因此，可尝试符合ICH要求的不同灯源。若采用氙灯，达到目标总照度(1.2*10⁶Lux hr)一般需要4小时左右，如果采用荧光灯或近UV灯，按输出5000-10000lux算需要5-10天才能达到目标总照度。有时，我们可以直接将样品置于太阳光照下进行降解试验。在炎热的夏天，样品置于太阳下光照4小时产生的降解程度与样品置于氙灯或金属卤化物灯下光照8天降解程度差不多。但需要注意的是，一年中太阳光的照度随季节在变。

需要注意的是，不管光降解反应的现象如何，仿制药的说明书均应与RLD的一致。

降解试验注意事项

样品浓度与降解程度

根据不同文献报道，加上实际经验，进行强制降解时推荐的起始样品研究浓度为1 mg/ml(后期可根据实际情况而决定是否需要调整)，如果样品溶解性差而达不到这个浓度的，可在样品中加入甲醇。样品浓度若太小，则有可能部分降解产物因浓度太低而不能被检测到。而对于溶液剂，推荐采用最终的处方浓度同时进行试验，因为有些药物如氨基青霉素，在一定浓度下会发生聚集现象，低浓度下药物很少发生聚集。

对于小分子药物而言，强制降解一般以主成分降解5% - 20%为宜；而对于要求含量为标示量的90% - 110%的小分子而言，建议最大主成分降解为10%。过度的降解容易造成二次降解产物，而这些二级产物又可能不会出现在药物货架期稳定性研究期间内产生，即不符合降解试验的最终目的。

样品处理方式

样品经过酸、碱、氧化剂降解后，一般含有较高浓度的残留反应剂，直接进样会有损液相及色谱柱。对于样品的处理，可采用稀释法或中和法，其中稀释法更为推荐。对于稀释法，即将样品中残留的反应剂通过稀释至能够耐受的范围内：如果采用HPLC法，稀释剂可使用流动相；如果采用TLC法，稀释剂可采用甲醇、乙醇等。对于酸碱中和法，即在样品中加入酸或碱，使样品溶液的pH将至耐受范围内。稀释法操作更简单，而中合法难以把控终点。

实验设计建议

对于强制降解试验，我们最好是能准备四种样品进行对比试验：1)放置于常规条件下的空白溶液；2)放置于降解条件下的空白溶液；3)放置于常规条件下的样品溶液；4)放置于降解条件下的样品溶液。最终通过对这四种溶液的综合判断评估真实的降解产物。

在进行降解试验过程中，间隔取样有时是有必要的，有利于阐明降解过程、从而识别降解产物到底是一级降解产物还是二级降解产物。

在使用药典和USP <621>中概述的限制使用的方法，降解试验是没有必要研究的。同一个药物的不同晶型可能具有不同的稳定性特征，当一个仿制药产品晶型不同于RLD产品晶型时，原料药应进行降解试验来评价多晶型药物的理化变化。

主要参考资料：

1. Guidance on Conduct of Stress Tests to Determine Inherent Stability of Drugs

2. FDA Perspectives: Scientific Considerations of Forced Degradation Studies in ANDA Submissions

3. ICH Q1A (R2)、Q1B

4. 化学药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则(修订)