ADC下游纯化策略汇总

在过去20年间ADC类药物的研发成为各大药企竞争的热点，已经有超过10种ADC类药物已经获得FDA的批准（图一），另外还有百余种ADC类药物处于临床试验或者药学研发阶段。因此开发出稳健的ADC平台化工艺流程对各大制药企业来说至关重要。

ADC类药物的结构（如图二所示）可以分为五个部分，单克隆抗体：与肿瘤细胞表面抗原产生亲和力起到靶向的作用；载荷药物：载荷药物需要有较高的细胞毒性以杀死肿瘤细胞，常用的荷载药物有奥瑞他汀衍生物（MMAE、 MMAF）、美坦新衍生物（DM1、DM4）、与DNA小沟结合的毒素（卡奇霉素等）；此外单克隆抗体与荷载药物之间还需要通过结合位点（conjugation site）、连接子（Linker）以及附着臂（attachment）进行连接。其中连接子的稳定性至关重要，它需要在ADC运输至细胞内小体后，又必须在肿瘤靶细胞的胞质中将细胞毒性小分子释放出来。由于其复杂的结构使得其下游纯化难度也大大增加。如图三所示，ADC类药物纯化过程可分为两类：1、切向过滤（TFF）：超滤渗滤 (UFDF);2、层析：尺寸排阻色谱（SEC）、疏水色谱（HIC）、羟基磷灰石层析（HA）以及膜层析（MC）。

1、切向流过滤（TFF）

切向流过滤中的超滤渗滤（UF/DF）工艺，已经广泛应用于ADC类药物的纯化工艺中。由于用于去除有机杂质、偶联相关杂质以及用于缓冲液的置换（通常需要将单克隆抗体置换到适合的缓冲液中进行偶联药物）。此外，UF/DF作为ADC纯化过程中一种工艺其收率也可保持在90%以上，相关研究表明小分子杂质（有机杂质、偶联相关杂质）分子量要低于膜孔径，因此过滤过程中pH、膜载量、跨膜压差以及流速对于小分子杂质去除影响较小，工艺具有较强的稳健性。

值得注意的是，在一些特殊的案例中由于连接子复合物具有较高的疏水性，在缓冲液中有可能发生自缔合作用，产生难溶性胶束，这些胶束则难以通过UF/DF步骤去除，通常需要配合后续相关层析工艺进行去除。总的来说UF/DF工艺对于ADC类药物的纯化来说是稳健且通用的方法。但是UF/DF本身也具有一定的缺陷：1、由于聚集体的分子量较大（通常和ADC的分子量相当甚至分子量大于ADC的分子），因此使用UF/DF系统难以去除聚集体类的杂质；2、UF/DF难以区分不同的载荷量（DAR），因此UF/DF过滤之后为不同DAR的混合物，仍需要进一步纯化。

2、尺寸排阻色谱（SEC）

尺寸排阻色谱是一种基于分子量差异而进行分离纯化的一种层析方式，对于ADC类药物的纯化来说具有至关重要的作用。SEC在ADC纯化过程中可以起到缓冲液置换（脱盐）、去除非蛋白杂质（小分子杂质，如小分子细胞毒性药物）、以及去除聚集体等作用。此外SEC通常在较为温和的条件下进行层析（中性pH缓冲液以及室温条件），有利于ADC类药物维持稳定。因此，SEC是ADC纯化的一种金方法。通常我们选择SEC来进行纯化时，通常假设没有二级作用即ADC分子与SEC填料没有别的相互作用力如疏水力以及离子作用力，然而事实有多篇研究报道ADC分子与SEC填料存在相互作用，因此在工艺开发，填料筛选阶段我们需要尽可能选择相互作用小的填料来进行工艺开发。

3、疏水作用色谱（HIC）

ADC类药物的纯化除了应该关注小分子类杂质、聚集体外还应该注重DAR（药物-抗体比率）类杂质的去除。对于DAR类的杂质由于SEC层析岁DAR的分辨率较低，因此DAR类的杂质通常需要通过疏水作用色谱来进行去除。由于ADC药物共价偶联了疏水性药物连接子（Linker）,因此ADC类药物与单克隆抗体以及不同DAR值的杂质具有疏水性差异，因此可以通过疏水层析进行去除。如基于半胱氨酸偶联的ADC，DAR<8,通常会产生五种不同的产物（即dar=0,2,4,6,8），对于情况可以通过疏水作用色谱结合线性梯度进行分离。通常来说可以在层析缓冲液中添加硫酸铵来辅助疏水层析过程中对目标产物的捕获，然而在adc类药物纯化的过程中，硫酸铵的添加往往会导致收率偏低，因此针对这种情况可选用疏水性较弱的nacl来克服上述问题。<>

综上所述，使用HIC来对ADC类药物进行纯化，对DAR类杂质具有较好的分离效果，但是HIC层析仍然有峰分辨率低、收率偏低的问题，需要在工艺开发阶段着重优化。

4、离子交换色谱（IEC）与羟基磷灰石层析（HA）

离子交换色谱和羟基磷灰石层析常常应用于单克隆抗体的纯化过程中，但是将这两种工艺应用到ADC类药物实例较为有限。其中离子交换色谱通过目标产物与杂质电荷差异来进行分离纯化，可以应用于小分子类杂质、宿主DNA、内毒素以及电荷变异体等杂质的去除，因此离子交换是ADC类药物精纯阶段具有潜力的候选工艺。而羟基磷灰石层析，在ADC类药物去除聚集体的方面表现较为出色（有研究表明采用羟基磷灰石层析可以使抗体中聚集体的含量由纯化前的60%下降到0.1%），综上所述，离子交换色谱以及羟基磷灰石色谱展现出一定ADC药物纯化的潜力。

5、膜层析（MC）

相比于传统的柱层析的诸多缺陷（收率较低、IEC,HIC层析时通常需要一定浓度的盐来进行洗脱，盐的存在不利于样品的稳定储存），膜层析则收率较高、并且通常流速也较高，可缩短工艺时间节省成本。因此，有研究人员将目光转向膜层析，希望以此来代替传统的柱层析。有研究表明使用Sartobind membrane来对ADC类药物进行纯化的时候，可以有效去除聚集体以及药物连接子。进一步研究表明将含有不同作用模式的层析模，进行串联的时候可相互促进从而增强纯化效率。

例如将SEC和HIC膜进行串联时，SEC膜的脱盐作用可以促进HIC膜对DAR类杂质的分离作用。类似地，有研究将Sartobind S and Sarto bind Phen两种膜进行串联，后可在高流速，低压力的条件下去除聚集体。相信随着技术的进步，这种无需层析柱的膜层析将会在ADC类药物纯化工艺中大放光彩。

图5 ADC类药物纯化策略

展望：ADC类药物发展势头迅猛，在未来会在精准化医疗方面实现价值。随着技术的进步，ADC类药物的研发也会更上一个台阶。首先，已经有研究探索使用酶催化的手段进行小分子化学药品与单克隆抗体的偶联，由于酶反应的特异性使得ADC分子的DAR变得可控，然而由于酶分子与ADC类药物生化性质相近，因此在后续纯化中将酶分子去除有一定挑战性，在未来需要探索合理的纯化策略来去除酶分子。此外，化学特异性位点偶联法合成简单，并且所产生的杂质均为小分子物质可轻松通过TFF的手段进行去除，因此也是ADC类药物极具潜力的合成方法。除此之外，近年来双特性抗体相对于传统抗体来说具有减毒增效的优势，在未来或许有机会使用双抗分子甚至双抗分子片段去偶联小分子毒性药物，形成新型ADC分子。

参考文献

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[2]Matsuda Y ,  Yamada K ,  Okuzumi T , et al. Gram-Scale Antibody–Drug Conjugate Synthesis by Site-Specific Chemical Conjugation: AJICAP First Generation[J]. Organic Process Research & Development, 2019, 23(12).

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