抗体偶联药物（ADC）简介

ADC分子由单抗、连接子和有效载荷组成（图2）。

图3展示了ADC药物的主要作用机制。ADC分子从脉管系统进入肿瘤组织，结合到肿瘤细胞表面靶点，然后通过内体-溶酶体途径内化，在那里连接子被裂解和/或抗体被降解以释放有效载荷，最终扩散到细胞质中以到达其作用靶标（微管蛋白），以破坏微管动力学。其他广泛使用的有效载荷，如卡列卡霉素靶向DNA，须进一步从细胞质扩散到细胞核（图3中未显示）^[3]。

如果细胞毒性代谢产物可自由通过细胞膜并扩散，则可进入邻近细胞，发挥旁观者效应杀伤作用。

图3. 配备有效载荷（Auristatin, Maytansine）的ADC作用机制^[3]

全球范围第一个ADC药物Mylotarg^®于2000年获得FDA上市批准。自2019年以来，获准上市的ADC数量翻了一番多，2019-2020年共有5个ADC获得上市批准。

目前全球范围已上市ADC药物在各地区销量都呈现良好的增长趋势。2016-2020年，美国ADC药物市场销售额从3.29亿美元增长至14.7亿美元，年均复合增长率高达45%；欧洲和日本ADC药物市场销售额年均复合增长率也分别有13%和21%^[5]。

在我国，目前已上市6款ADC药物，其中烟台荣昌生物的维迪西妥单抗于2021年6月获得NMPA批准上市，成为我国首个国产化ADC新药。

Mylotarg^®（吉妥珠单抗-奥佐米星）是全球范围首个上市的ADC药物，由辉瑞和惠氏联合研发，早在2000年就获得了FDA的加速批准，用于首次复发、60岁以上、CD33+、不适合细胞毒化疗的急性髓细胞白血病治疗。其上市后不久，因安全性问题于2010年6月宣布自主撤市。随后更新了临床数据，调整了规格，最终在2017年，Mylotarg^®通过将原给药方案9 mg/m²调整至3 mg/m²，这款历经17年磨练的ADC再次获得FDA批准上市^[4,6]。

Kadcyla^®（恩美曲妥珠单抗）由罗氏和ImmunoGen共同研发，于2013年2月22日被FDA批准用于治疗既往已接受赫赛汀^®和紫杉烷化疗的HER2阳性转移性乳腺癌，是全球首款被批准用于实体瘤的ADC药物。Kadcyla^®属于第二代ADC，采用人源化单抗，更有效的细胞毒药物，即降低了免疫原性，又提升了毒性药物活性。

临床研究证实，与对照组相比，接受Kadcyla^®治疗的中位PFS（9.6个月）有显著提升，且总生存率（OS）也有所提高（29.9个月 vs 25.9个月）。2020年1月该药成功在中国获批，它是我国首个获批上市的ADC药物。2021年Kadcyla^®全球销售额为21.8亿美元，位居ADC药物销售额首位^[4,6]。

ADC分子的结构复杂且精巧，其分子设计需要考虑抗原、抗体、有效载荷、连接子及偶联策略的选择等不同方面的多重因素及因素间的关联^[7]。各种具体考量因素参见图7。

有效载荷（Payload）是ADC发挥细胞毒性作用的关键组成部分，必须满足几点主要要求：（1）高度细胞毒性，通常IC50值为低纳摩尔或皮摩尔水平（见图8）；（2）明确的靶点和作用机制；（3）（潜在）化学附着位点。

美登素衍生物（DM1/DM4）或Auristatin（MMAE/MMAF）是常用的微管抑制剂。其他种类的细胞毒性药物包括烯二炔（卡列卡霉素）、多卡霉素衍生物、吡咯并苯二氮杂松（PBD）和吲哚并苯二氢杂松，它们都靶向DNA的小凹槽；此外还有喹啉生物碱（SN-38），能抑制DNA拓扑异构酶I。

在114项已完成或正在进行的临床试验中，所使用的药物有效载荷缺乏多样化，仅报告了7种有效载荷制剂（另有4项试验正在进行，结构未报告）。七种有效载荷混合物中的六种来自天然产物来源，表明天然产物在ADC有效载荷类型中的关键价值^[8,9]。

ADC开发中最大的挑战之一是选择合适的连接子，以将细胞毒性有效载荷与抗体结合。连接子化学影响ADC的各种特性，包括毒性、特异性、稳定性和效价。ADC常用连接子技术和释放机制见表2。

表2. ADC链接子技术和释放机制

连接子可大致分为可裂解型（有效载荷能够与肿瘤部位的单抗分离）或不可裂解型（有效载荷和单抗保持结合，单抗在内化后降解），见图9。

常见的可裂解连接子有化学活性连接子、 酸可裂解连接子、可还原链连接子和酶可裂解连接子。不可裂解连接子在肿瘤环境中抗体药物结合物的溶酶体降解过程释放离细胞毒性有效载荷，绕过毒性制剂的非特异性分散。不可裂解连接子的一个优点是提高了血浆内的稳定性，脱靶毒性降低。

Mylotarg^®使用了对酸不稳定的腙连接子策略。理论上，腙在生理pH下在血液循环中应该是稳定的，并且在酸性更强的条件下内化后会发生选择性水解（内体（endosome）的pH值分别为5.0–6.5，溶酶体（lysosome）的pH值为4.5–5.0）。然而，有报道表明Mylotarg^®连接子表现出一定的不稳定性，导致有效载荷在血浆循环中过早地释放，可能导致脱靶毒性。受益于近年来在临床上积累的知识，辉瑞降低了该药的使用剂量，并修改了给药方案，最终于2017年被FDA重新批准^[2,11]。

每个抗体的平均有效载荷分子数通常称为药物抗体比率（DAR）。DAR决定了可以输送到肿瘤细胞的“有效载荷”的数量，并且可以直接影响安全性和疗效。高药物负载通常会导致快速血浆清除，而DAR较低的ADC表现出较弱的活性。

临床上成功的ADC的设计不仅取决于有效载荷的效力及其比率、连接子稳定性和有效载荷的释放等因素，还取决于偶联技术的选择。

过去十几年中，FDA批准的所有ADC都是由不同数量的药物附着在单克隆抗体不同位置的ADC混合而成的。目前业界已经开发了一系列新的偶联策略，旨在控制有效载荷的链接位置和数量，同时保持结构完整性和同质性^[5,10]。

上市ADC药物制剂的药物成分浓度常低于20 mg/mL，因其高选择性和有效性避免了使用高浓度。较低的浓度降低了聚集的风险，特别是对于具有疏水有效载荷的ADC分子，这是一个重要的优点，因为与单抗本体相比，ADC的溶解度可能会降低。但由于临床上ADC药物常通过输液给药，在输液袋中，ADC浓度较低也会带来问题，尤其是疏水有效载荷会增加由于吸附到塑料材料表面上而导致药物损失的风险。

对于ADC产品而言，液体制剂可能面临稳定性问题，而冷冻干燥制剂可减少储存期间连接子的降解。目前批准上市的ADC药物制剂几乎都是冻干剂型。

另外一个有趣的现象，一些ADC制剂比传统抗体可能更为光敏，如Mylotarg^®、Besponso^®、 Enhertu^®的内包材均为棕色西林瓶。

表3. 几种已批准ADC药物的处方信息

ICH Q8 R2对关键质量属性定义和解释为：“关键质量属性是应该在适当的限度、范围或分布之内的物理、化学、生物或微生物性质或特性，用以确保所需的产品质量（安全、有效）”。因此，理解ADC药物的CQA，对于ADC药物开发有着重要意义，一些常见的ADC药物关键质量属性如表4所示。

表5和表6展示了上市ADC产品Mylotarg^®原液和成品的详细CQA信息，以供读者参考。

表6. 上市ADC产品Mylotarg^®成品CQA（FDA审评报告: FDA Product Quality Review Report_BLA 761060 Mylotarg）

此外，有别于FDA披露的信息，在Mylotarg^® 的EMA上市审评报告（EMA/155284/2018_ Mylotarg Assessment report）中显示，其原液的质量标准包括一般属性、鉴别、纯度、生物活性、产品相关杂质和安全性测试。此外，原液结构表征包含翻译后修饰、电荷&大小异质性、偶联位点、卡列卡霉素衍生物偶联程度、高级结构和生物学活性等信息。

一般情况下，用于常规抗体药物的分析工具也可能适用于ADC药物分析，但并非所有方法都可以无缝切换使用。例如，如果ADC的有效载荷具有紫外吸收或样品高度异质；或者，在分子排阻色谱法（SEC）中，如ADC具有疏水有效载荷结构，可能需要通过向流动相中添加有机溶剂来减少与色谱柱的强疏水相互作用。

以下列举几种ADC药物特有的质量属性分析：

药物-抗体比率（DAR）的测定

紫外-可见光谱法是一种简单且实用的测定方法，但该方法有使用的先决条件：1）有效载荷应含有紫外可见发色团；2） 有效载荷和抗体在其紫外-可见光谱中应表现出明显且分离的最大吸收峰；3）有效载荷的存在不能影响抗体部分的吸收特性，反之亦然。

疏水作用色谱（HIC）依赖于基于抗体上附着的疏水有效载荷的数量来分离偶联物。疏水性最低的未偶联抗体首先从柱中洗脱，具有最高DAR的偶联物最后洗脱。除DAR外，该方法还可给出ADC的偶联水平，是ADC药物分析的经典色谱技术。

质谱法是表征ADC结构的一种功能强大的技术，可以分离、鉴定和定量分子种类，也可以用于测定DAR。

载药分布的测定

整体的载药分布可通过质谱法完整分子量进行分析，对于通过半胱氨酸或其他定点偶联产生的异质性较少的ADC，也可以使用疏水作用色谱法来表征。为了确定每个偶联位点的载药分布，需要进行更全面的分析，如还原质谱肽图。

反相高效液相色谱（RPC）或毛细管电泳（CE）作为正交测试方法，在样品还原条件下可以提供关于有效载荷在轻、重链上分布的信息。

未偶联抗体的测定

未偶联抗体水平是工艺控制中的关键参数，因为它可以直接影响ADC药物的疗效。质谱法是未偶联抗体定量的常用工具。由于有效载荷或连接子的固有亲脂性，（疏水性）有效载荷的结合也会改变蛋白质分子的疏水性，因此疏水作用色谱法也可用于测定ADC样品中未偶联抗体的水平。

由于有效载荷与抗体的结合可极大地改变表面和整体电荷分布，全柱成像毛细管等电聚焦电泳（icIEF）也是一种可供选择的分析工具。此外还有其他方法可供尝试，如：反相高效液相色谱、毛细管电泳、酶联免疫吸附（ELISA），等。

值得一提的是，质谱分析技术是ADC药物结构表征的强大工具，在ADC药物工艺开发和质量分析等应用方面起着不可或缺的重要作用，质谱在ADC药物质量分析方面的常见用途详见图11。

图11. 基于质谱技术的ADC结构表征策略：可以对完整的ADC、单抗、细胞毒性有效载荷或连接子结构进行深度表征[^14]

工艺开发

与任何其他活性药物成分（API）类别相比，ADC药物的质量更加受生产过程的制约。为了可重复性生产出成分不均一的化合物子集，一个完善的生产工艺是必不可少的。为了确保工艺一致性，需要对偶联工艺过程的众多参数进行研究和控制。生产过程中适当的加工、储存和处理条件的选择，应基于中间体和ADC的物理化学稳定性研究数据。

精细的工艺开发还需要经验丰富、训练有素的实验人员，以及合适的实验设备。

为了能够用很少的材料进行更多实验，可以在精确控制温度的同时以毫克级进行偶联实验的微型夹套容器被证明是非常有用的，该反应模型被证明可以模拟高达几百升的反应性能；但对于纯化工艺，需要进行克级运行，以评估切向流过滤（TFF）条件。

规模化生产

ADC药物生产中最大的挑战可能是生物制造环境的设计、建造和操作，该环境允许安全地操作强效细胞毒性药物及其污染物（如：含有毒性物质材料的传递、污染物处置）。因此，应强化人员培训，以确保正确使用设备并遵守安全理念；此外还应拟定个人防护设备计划，涵盖工程控制无法消除的残余风险，以及毒性化合物泄漏的应急预案。

在制造强效细胞毒性药物时，设备清洁是另一项关键活动。一次性使用技术可以减少清洁操作成本，但材料通常是昂贵的，此外可能还需要提供浸出和可提取数据。因此，通常优选玻璃或不锈钢容器用于偶联反应。

ADC生产线的清洁验证需要高灵敏度的检测手段，通过基于传统TOC和HPLC的方法检测残留细胞毒素通常不能提供足够的灵敏度，可能需要用到经过验证的ELISA或LC-MS分析方法。

尽管ADC的设计很复杂，但近几十年来，这一治疗课题的前景引起了人们的极大兴趣。当前强大的在研临床管线和不断获批的ADC药物就是前景光明的最好例证^[10]。除了目前广泛应用在肿瘤治疗领域外，ADC概念在其他治疗领域也具有潜在应用，如治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染、万古霉素耐药的细胞内金黄色葡萄球菌感染或抗炎症^[1]。

当前ADC候选药物的临床前先导选择方法通常依赖于对各种抗体、连接子和细胞毒性有效载荷的基质进行系统的体外评估，而体外模型是否足以预测药物响应仍有待观察。在进一步了解ADC之前，早期体内研究可能至关重要^[10]。

ADC药物的主要挑战之一是脱靶毒性（off-Target Toxicities），这是细胞毒性小分子过早释放到血液循环中的结果。临床报道的脱靶毒性有肝毒性、血小板减少、周围神经病变、中性粒细胞减少和贫血，及眼部毒性等。此外，ADC药物复杂的潜在耐药（Drug Resistance）机制有待阐明；并且在治疗组合的背景下，从其他给药化合物中识别对ADC的耐药机制也存在很大挑战^[10,11,16]。

尽管ADC药物的设计、工艺和产品的开发及临床实践存在诸多挑战，但随着对现有ADC进行更多临床试验和基础研究，将为解决肿瘤标志物、抗体、细胞毒性有效载荷和偶联策略等问题铺平道路，ADC药物的未来充满希望。