PROTACs改造新策略：CRBN配体修饰大幅降低脱靶

靶向蛋白降解嵌合体（PROTACs）也称为异双功能降解剂，是一种新兴的治疗方式。PROTAC由靶蛋白的配体，E3 泛素连接酶小分子配体和连接链组成。PROTAC可以招募E3泛素连接酶与目标蛋白形成一个三元复合物，诱导靶蛋白泛素化，进而导致其被蛋白酶体降解。

PROTACs的设计可以描述为一个四个阶段的线性系统过程，根据每个步骤的特定目标按顺序设计。第1阶段为识别选择性靶标结合部分（TBM），第2阶段为优化TBM活性和选择性，在第3阶段为评估E3连接酶结合部分（EBM）以及在第4阶段中优化连接链。根据每个阶段的结果，可以进行迭代过程以重新优化早期设计元素（图1）^[1]。

PROTACs的发现有望克服传统小分子抑制剂的一些局限性。PROTAC诱导的降解是形成具有泛素化能力的三元复合物，而不依赖于直接阻断一个活跃的位点。因此，可以使用PROTACs降解那些有小分子结合配体，但这些小分子疗效不佳的靶标蛋白，扩展了可成药靶标。PROTACs还具有催化作用，避免了像小分子长时间占有才能发挥药效。而且PROTACs是降解整个蛋白，可以破坏蛋白质的酶和非酶功能（例如支架）或转录功能，而不是单单抑制蛋白的活性，可以克服传统小分子的耐药性。

由于这些优点，PROTACs吸引了国内外药企纷纷加入布局，不仅包括默克、基因泰克、辉瑞、诺华、勃林格殷格翰等制药巨头，也包括一些新成立的专门开发PROTACs的公司如Arvinas、C4 Therapeutics和Kymera Therapeutics等，目前有大约20个降解剂进入临床（图2）。

E3泛素连接CRBN已被广泛用于降解剂的设计，常见的CRBN配体包括：免疫调节药物沙利度胺、来那度胺和泊马度胺（图3）。

与VHL相比，CRBN配体的分子量小，更易于优化成药性，因此进入临床实验的PROTACs大多数是基于CRBN配体设计的。但它们普遍存在一个选择性的问题。

免疫调节药物结合到CRBN蛋白C端的疏水口袋后，CRBN配体可作为分子胶在CRBN上诱导形态表面改变并导致招募、泛素化和随后被蛋白酶体降解一些neo-substrate，如 Ikaros (IKZF1)，Helios (IKZF2)、Aiolos (IKZF3)、SALL4和GSPT1等，因此使用CRBN配体用于降解剂的常具有脱靶效应，缺少对靶蛋白的选择性。

虽然在某些情况下，降解靶蛋白和neo-substrate可能是有益的，但是降解neo-substrate会导致一些不需要的毒性，如：Ikaros 和 Aiolos 对淋巴细胞发育很重要，SALL4降解与致畸性相关，ZFP91 被证明是对 T 细胞功能很重要。

降解neo-substrate的原因是CRBN配体的戊二酰亚胺基团结合在CRBN 表面的沙利度胺结合位点的三色氨酸笼中。随后异吲哚酮或邻苯二甲酰亚胺与neo-substrate关键识别序列形成新的相互作用，这个关键识别序列称为结构降解子。这个结构降解子是含有必需甘氨酸残基的 β-发夹环。

许多neo-substrate是Zinc-finger转录因子，它们含有G-loop降解子，这些是很难用传统的小分子靶向的靶点，因为它们缺乏合适的结合口袋。还有一些neo-substrate不是Zinc-finger转录因子但仍含有G-loop降解子。GSPT1 就是这样一个例子。GSPT1的分子胶尽管目前正在进行治疗急性髓系白血病的临床实验。由于其重要的细胞功能，因此敲除GSPT1具有广泛的细胞毒性。GSPT1脱靶降解可能会缩小治疗指数，这对于非肿瘤学适应症尤其重要。

正是由于CRBN配体可以导致脱靶效应，因此越来越多的课题组和公司加入到CRBN配体的改造中，以期提高CRBN的选择性。共晶结构表明泊马度胺的戊二酰亚胺环深埋在CRBN蛋白里，而只有邻苯二甲酰亚胺环易于修饰。

英国癌症研究院的一个课题组报道了一类沙利度胺类衍生物，它可以不降解neo-substrate，但仍可以用于降解剂的设计上，降解靶蛋白。

他们首先以CC-885为例。CC-885可以降解GSPT1、 IKZF1和IKZF3。在苯环7位引入甲氧基得到化合物2，它与CC-885具有相似的CRBN结合能力，但可以阻断neo-substrate的降解。如图3所示化合物2不降解GSPT1、IKZF1和IKZF3蛋白^[2]。

随后他们将这一类CRBN配体用于BRD9降解剂的设计上。他们首先设计了泊马度胺作为CRBN配体的降解剂（化合物15），和甲氧基取代的泊马度胺作为CRBN配体的降解剂（化合物16）。如图4所示，化合物15和16都具有较好的CRBN结合能力。都可以很好的降解BRD9，但化合物16表现出更好的选择性，不降解neo-substrate。而且他们还做了proteomics实验，只有化合物16选择性的降解BRD9。

美国的丹娜法伯癌症研究院研究者们分析了14种密切相关的沙利度胺衍生物对GSPT1和IKZF1的降解。他们详细的探究了取代基对活性的影响，研究结果发现4-羟基取代的邻苯二甲酰亚胺都不降解，4-羟基取代的异吲哚啉酮降解IKZF1。

5-羟基取代的异吲哚啉酮和5-羟基取代的邻苯二甲酰亚胺都降解GSPT1而不降解IKZF1，并且5-羟基取代的邻苯二甲酰亚胺降解GSPT1能力强于5-羟基取代的异吲哚啉酮，因此5位取代对GSPT1降解至关重要，正如分子胶CC-885和CC-90009。

5-氨基取代的邻苯二甲酰亚胺和异吲哚啉酮都不降解GSPT1，微弱的降解IKZF1。6位和7位取代都不降解。这些发现也可用于PROTACs的设计上来避免脱靶效应（图5）^[3]。

哈佛大学、麻省理工学院布罗德研究所也在bioRxiv发表了一篇类似的报道。他们基于泊马度胺的改造发现特定位置（C5）的取代显着降低了neo-substrate的降解倾向。

4位，5位取代含有氢键供体都可以导致Zinc-finger 结构域的降解。随后它们在4位、5位进行改造了，合成了一系列化合物。相同的化学结构改造，5位比4位更容易降低Zinc-finger的降解，可能是5位改造更能与Zinc-finger的domain 形成位阻。

它们的结构改造同样也说明了基于泊马度胺的PROTAC用有芳胺连接（其中 NH- 是氢键供体），可诱导Zinc-finger降解，没有氢键供体的PROTAC具有最小的脱靶活性。与之前的报道一致。作者通过在C6位置添加氟基团，氟基团引入可以继续减少Zinc-finger的降解。

最后作者给出了两条主要规则来设计基于泊马度胺的PROTAC，以尽量减少脱靶效应。首先，连接链连接位置尽量选择C5位置；其次，氢键供体不应连接邻苯二甲酰亚胺环（图6）^[4]。

类似的。日本的课题组在Nature Communications也发表了类似的工作。他们展示了6位修饰的来那度胺对于控制新底物选择性至关重要，6-氟来那度胺诱导参与抗血液系统癌症活性的IKZF1、IKZF3和CK1α的选择性降解，并显示出对多发性骨髓瘤（MM）和骨髓增生异常综合征（MDS）衍生细胞系的抗增殖作用强于来那度胺，基于6位修饰来那度胺的BET降解剂具有相同的neos-ubstrate选择性（图7）^[5]。

沙利度胺和沙利度胺衍生物有两个化学环：戊二酰亚胺和邻苯二甲酰亚胺环。前者结合到CRBN蛋白的C端区域，后者导致neo-substrate的降解。邻苯二甲酰亚胺环的化学修饰对于neo-substrate的选择性至关重要。