细胞色素P450（Cytochrome P450s）是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白，其可以催化多种氧化反应，比如羟基化、环氧化、磺化等。由于可以有效氧化惰性碳，P450在药物和生物合成领域具有巨大的潜力。然而，细胞色素P450在催化过程中经常遇到低偶联效率的问题，从而限制了其在生物催化以及工业化中的广泛应用。偶联效率描述了细胞色素P450利用辅因子NAD(P)H的能力。低偶联效率意味着昂贵的辅因子NAD(P)H在反应过程中会有额外消耗，并生成解偶联副产物，如水（H2O）、过氧化氢（H2O2）以及超氧离子（O2-）等。尤为严重的是，在反应过程中生成的活性氧副产物会不断积累，最终造成P450酶和用于表达P450酶的工程菌失活。
图1. 通过理性设计底物结合口袋、配体访问通道和电子传递链来改造细胞色素P450酶的偶联效率。图片来源：Biotechnol. Adv.
近日，德国亚琛工业大学团队综述了理性设计具有高偶联效率的P450酶的工程化方法。研究人员从酶结构和催化机理出发，提出了三类改造P450酶的设计策略：
（1） 稳定P450s 的结合口袋中底物：高偶联效率需要P450的结合口袋与底物之间具有良好的“互补性”。一方面，合适的结合口袋有利于将底物稳定在正确的取向，以便血红素进行后续的氧化。另一方面，如果底物与结合口袋互补性较差，大量的水分子会涌入结合口袋，导致形成解偶联产物。简言之，稳定结合口袋的关键在于限制结合口袋中的底物运动，使其处于正确的催化构象。
（2） 利用配体访问通道调节底物/产物和水的运输：细胞色素P450的活性位点埋藏在酶的内部，其催化过程中需要通道来调控底物/产物和水的进出。因此，合适的通道对提高偶联效率极为关键。低效的通道会限制底物和产物的运输，造成底物/产物冗积在结合口袋中，最终导致P450反应流向解偶联途径。另外，藉由通道进入结合口袋中的过量水可作为质子供体，导致解偶联产物的形成。因此，“协调底物/产物有序运输”和“限制水分子扩散”两种策略可用于提高 P450s 耦合效率。
（3） 工程化电子传递链：电子传递一般是P450反应的限速步骤。如果电子供应不足，P450将倾向于生解偶联产物。然而仅有很少的研究针对于工程化P450的电子传递链。优化P450的电子传递有两种方法，第一种是针对电子传递链上的残基进行改造，特别是流向血红素辅因子的一小段电子传递链。第二种方法是改造影响 P450 血红素结构域和还原酶结构域之间相互作用的残基，例如连接子（linker），这同样可以有效地影响电子传递链的性能，进而提高耦合效率。
基于细胞色素 P450 的结构，可以在计算机上预测潜在的功能化区域，包括结合口袋、配体通道和电子传递链。随着对P450酶的的结构-功能关系的理解的加深，可以预期，蛋白质工程师们能够设计出更高效、更强大的 P450酶，并促进 P450 在药物和生物合成领域中的工业应用。
图2. 用于工程化改造细胞色素P450的最新技术。图片来源：Biotechnol. Adv.
Biotechnol. Adv., 2022, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2022.108051
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