光酶催化不对称亲电偶联

构建手性Csp3–Csp3键一直都是有机合成领域最大的挑战之一。随着药物研发对目标分子的结构空间需求逐步提高，亟待发展更多的立体选择性的Csp3–Csp3构建方法。交叉亲电偶联（cross-electrophile couplings, XEC）是一类将两个亲电试剂偶联形成碳-碳键的反应，通常由过渡金属催化。相较于传统的偶联反应，XEC具有更广泛的官能团耐受性，且无需使用敏感的有机金属试剂，故而有很广泛的应用。但在使用亲电偶联构建Csp3–Csp3键时，由于过渡金属催化剂通常难以区分两种不同的Csp3–亲电试剂，导致自偶联副产物难以避免。此外，不对称Csp3–Csp3XEC尚待发展（图1a）。

生物催化以高效、高选择性著称，美国康奈尔大学的Todd Hyster教授课题组的研究者尝试采用生物催化的方法来实现立体选择性的亲电交叉偶联反应。由于天然酶并不能催化还原偶联反应，他们发展了一种全新的非天然光酶催化策略，以α-卤代羰基化合物和硝基烷烃作为亲电试剂，在可见光激发的烯酮还原酶（‘ene’-reductases, EREDs）催化下，以高交叉选择性和对映选择性实现了Csp3–Csp3 XEC，相关成果发表在Nature 上。具体机理而言，α-卤代羰基化合物1在光照下被还原态的黄素辅酶（FMNhq）单电子还原产生自由基4（自由基引发），并对去质子化的硝基烷烃进行加成生成硝基阴离子自由基中间体6（自由基加成），随后该中间体发生C–N键均裂，脱去亚硝基阴离子并产生烷基自由基7（硝基离去），最后被立体选择性的氢原子转移（HAT）淬灭（自由基终结），得到交叉偶联产物3（图1b）。实现高交叉选择性的关键在于α-卤代羰基底物可与位于酶活性位点中的FMNhq形成电荷转移（Charge-transfer）复合物（CT complex），在可见光激发下，α-卤代羰基底物可优先选择性地发生单电子还原；实现高立体选择性的关键在于酶骨架控制的立体选择性HAT。

图1. 光酶催化不对称Csp3–Csp3亲电偶联。图片来源：Nature

首先，作者以α-氯代酰胺1a（Ep/2 = –1.65 V vs. SCE）和α-硝基苯乙烷2a （Ep/2 = –0.89 V vs. SCE）为模板底物，在青蓝光（Cyan light, λmax = 497 nm）激发下，筛选了一系列结构多样的烯酮还原酶，发现来自Caulobacter segnis菌株的烯酮还原酶（CsER）能够以92%的产率和95:5的er值得到(S)-型目标偶联产物3a。同时，以Gluconobacter oxydan菌株来源的烯酮还原酶（GluER-T36A）为催化剂，能够以51％产率和10:90的er值得到构型翻转的(R)-型产物3a（图1c）。对照实验证实，烯酮还原酶、Cyan光和NADPH重生系统（GDH/NADP+/葡萄糖）对于反应性至关重要。

随后，作者对该光酶催化体系的底物范围进行了探索（图2）。多种类型的α-芳基取代硝基烷烃（自由基受体）都可以很好地与α-氯代酰胺1a发生交叉亲电偶联反应。如苯环的间位或对位可兼容带有不同电性的取代基，以80-98%的产率以及优异的对映选择性（>97:3 er）得到β-手性酰胺交叉偶联产物（9-16）。苯环邻位取代的硝基烷烃底物在反应中的耐受性较差，仅可接受邻位氟取代的α-苯基硝基乙烷为底物，以28%的产率和94:6 er 值得到产物8。此外，该体系还可以兼容不同杂环，包括富电子的α-噻吩和缺电子的α-吡啶取代硝基乙烷，以40-95%的产率和高对映选择性（最高99:1 er）得到相应的β-杂环取代手性酰胺产物（22-24）。同时，α-硝基酯也能以96%的产率得到β-手性1,4-二羰基产物25，突显出该光酶体系广泛的底物谱。另外，多种不同类型的α-卤代羰基化合物（自由基前体）均可被该体系兼容，包括α-氯代酰胺（二级、三级、直链或环状酰胺），α-卤代酯和α-卤代酮均可与硝基烷烃反应得到相应的β-手性取代酰胺、酯和酮产物（26-37）（图2）。值得一提的是，酶产物还可进一步转化，如β-手性酰胺3a可以还原成相应的γ-手性胺41（70%产率，95:5 er）。酶产物16可以水解得到β-手性酸42，进一步还原可得到γ-手性醇43（75%产率，99:1 er）（图3）。

图2. 光酶催化XEC的底物范围。图片来源：Nature

图3. 酶产物转化。图片来源：Nature

作者对反应机理进行了深入的研究。首先，作者通过UV-Vis光谱实验发现α-氯代酰胺底物1a与FMNhq在酶的活性口袋内形成了电荷转移复合物。当硝酮38（nitronate模拟物）添加到含有1a和CsRE-FMNhq的样品中时，可以观察到CT复合物光谱进一步增强，这表明可能形成了四元CT复合物，而这个四元CT复合物则是实现光促选择性还原底物1a的关键，同时也是实现高效分子间自由基加成的保证（图4a）。随后，作者对硝基离去步骤进行了研究。作者发现当使用α-硝基甲苯2l在标准光酶催化的条件下与1a反应时，可得到比例约为1:1的交叉偶联产物18（28%产率）和保留硝基的化合物40（29% 产率）的混合物。将化合物40分离后重新在标准光酶催化的条件下反应，并未检测到偶联产物18，说明化合物40不是偶联产物18的前体。作者推测产物40可能是由FMNsq氧化相应阴离子自由基得到，这表明该阴离子自由基的脱硝基步骤与被FMNsq氧化之间存在竞争（图4b）。最后，通过对标准反应进行了密度泛函理论（DFT）计算，作者发现α-酰胺自由基Int-1可与nitronate 5 快速加成，反应的自由能垒仅为9.9 kcal mol-1。生成的阴离子自由基Int-2可发生不可逆的脱硝基步骤（自由能垒为9.7 kcal mol-1）产生烷基自由基中间体Int-3，随后可被FMNsq通过HAT淬灭得到产物3a（图4c），氘代实验同时证明了HAT的氢源来自于FMNsq（见SI）。

图4. 反应机理研究。图片来源：Nature

小结

本文以易得的α-卤代羰基化合物和硝基烷烃作为亲电试剂，实现了首例光酶催化的不对称Csp3–Csp3交叉亲电偶联，拓展了酶催化反应类型的边界，对现有化学方法起到很好的互补。本文利用生物催化剂所特有的高选择性，通过发展新的反应机理和使用非传统底物，实现了传统化学催化难以实现的反应类型，使生物催化剂在合成中变得普适更进一步。

Nature, 2022, DOI: 10.1038/s41586-022-05167-1