治疗丙肝的HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂

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HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶

华盛顿大学的Charles Rice于1996年完成了丙型肝炎病毒（HCV）病毒基因组的表征，一年后他在实验室中成功地合成了这种传染性病毒。之后，他继续开发了这种病毒的亚基因组扩增子，这种扩增子可以在不产生活病毒的情况下在细胞中复制，这使得设计检测方法来测试能够直接抑制病毒复制的药物成为可能[1]。

1989年对HCV的分离和详细描述为药物发现奠定了基础，重点是发现和开发专门针对病毒蛋白和核酸直接作用的抗病毒药物。预计这些HCV抑制剂在改善应答率方面具有相当大的潜力，治疗的耐受性高于干扰素和利巴韦林联合用药。乙型肝炎在很大程度上是一种发展中国家疾病，但丙型肝炎却在许多有能力购买昂贵创新药物的发达国家肆虐。

自HCV被发现以来，学术界、政府机构尤其是制药行业投入了大量资源，发现了许多有效的抗丙肝药物。现在可以通过持续病毒学应答（SVR）来实现治愈。在可预见的未来，丙肝可能被根除。

Rice的发现对抗丙肝药物的发现有着重要作用。下面是与非结构蛋白相关的HCV基因组的一部分。几乎所有的HCV非结构蛋白都被证明是抑制HCV复制的有效靶标。

HCV NS3丝氨酸蛋白酶是HCV在人体中复制所需的几种酶之一。NS3蛋白有两个组分：N端丝氨酸蛋白酶和C端RNA解旋酶。它是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，分子量为75 kDa。在功能上，HCV NS3丝氨酸蛋白酶负责在4个位点切割病毒多聚蛋白，包括NS3-4A、NS4A-4B、NS4B-5A和NS5B-5B连接处。

换句话说，HCV NS3蛋白酶将大的非功能性多肽切割成较小的功能性蛋白。抑制这种酶会阻止病毒的复制过程。短肽辅因子NS4A可增强NS3蛋白酶的稳定性和活性。为了使NS3蛋白酶作为一种蛋白酶具有活性，它必须与NS4A结合。这就是NS3抑制剂与NS3/4A抑制剂通用的原因。

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HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂

BI（Boehringer Ingelheim）的开创性工作

HIV蛋白酶抑制剂药物的突破性发现表明，HCV NS3丝氨酸蛋白酶可能是设计新型口服抗HCV药物的一个可行靶点。利用X射线晶体学确定了酶的固态结构，有助于启动基于结构的药物设计（SBDD）工作。然而，这种晶体结构也揭示了，与HIV蛋白酶的深层“可成药”的底物结合口袋不同，HCV NS3的底物结合区域是一个浅层暴露于溶剂的凹槽。

因此，从药物设计方面来看，NS3在设计该靶点的选择性和强效小分子抑制剂方面对药物化学家提出了重大挑战。一位Vertex化学家描述了这个靶标带来的困难：“试图将抑制剂降落在HCV蛋白酶靶标结合位点就像试图将飞机降落在一块披萨上——它平整而油腻，没有什么可以依附的”[2]。

随着药物化学团队开始设计和合成新的NS3蛋白酶抑制剂，使用功能性生化酶测定法完成了对抑制剂效力的初步评估。基于细胞的HCV复制子检测方法的最终开发能够在更符合生理学的细胞环境中评估新的抑制剂，从而使该靶标的发现工作取得了重大进步。

BI是第一家将HCV NS3蛋白酶抑制剂用于人体临床试验的公司。BI在其加拿大魁北克研究基地发现了蛋白酶裂解产物，并将其作为起点。他们开创性的候选药物西鲁普韦（ciluprevir）是一种大环药物，为这类直接作用的抗病毒药物建立了临床概念验证。

在西鲁普韦的临床试验中，HCV感染受试者给药2天后，观察到血液中HCV RNA下降了100多倍。当他们停止服用西鲁普韦时，他们的HCV RNA水平恢复。令人遗憾的是，由于在高剂量恒河猴中观察到心脏毒性问题，西鲁普韦的 Ib期临床试验在2004年左右终止。

显然，西鲁普韦的心脏毒性具有分子特异性，而不是基于机制，因为后来在许多相同化学类型的化合物中没有发现此类心脏毒性。BI的西鲁普韦仍然是NS3/4A蛋白酶抑制剂领域的开创性贡献。

BI的后续候选药物法达瑞韦（faldaprevir）是一种基于三肽的NS3抑制剂，不存在困扰原型西鲁普韦的心脏毒性。它是一种无环分子，消除了大规模进行闭环复分解介导的大环生产的挑战。令人遗憾的是，由于商业原因，法达瑞韦的III期临床试验于2014年终止，因为许多来自竞争对手的HCV治疗药物已经上市。尽管是该领域的先驱，但BI在市场上没有HCV NS3抑制剂[3]。

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HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂

缓慢的可逆共价抑制剂

NS3蛋白酶抑制剂波普瑞韦（boceprevir）和特拉匹韦（telaprevir）是2011 年5月批准用于与聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合治疗HCV患者的首个HCV直接作用抗病毒药物。它们都是四肽衍生物，除了在催化丝氨酸-139和嵌入α-酮酰胺元素的活化羰基部分之间形成可逆的共价键外，还依赖于抑制剂和蛋白酶之间的广泛接触。这些药物是酶的缓慢结合、基于机制的抑制剂，可与蛋白质形成稳定但可逆的复合物。

为了解决HCV NS3/4A具有挑战性的底物结合位点，多个研究团队开始探索可逆性共价抑制剂的设计。这一策略为其他蛋白酶抑制剂提供了候选药物，涉及将亲电阱或“弹头”加入类似底物的抑制剂中。NS3蛋白酶催化位点丝氨酸在亲电弹头基团上的可逆亲核加成可以赋予抑制剂相当大的效力和选择性优势，使具有吸引力的药代动力学特性的低分子量候选药物成为可能。

在2009年被默克公司收购之前，先灵葆雅（Schering–Plough）是个大制药公司。20世纪初，它已经将首个聚乙二醇化重组干扰素（Intron A）作为第一个获批的HCV治疗药物推向市场。因此，丙肝是该公司非常感兴趣的一种疾病。他们选择寻找HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂，因为该酶在病毒生命周期中发挥着至关重要的作用。

此外，结构生物学的行业领导者先灵葆雅在应对丝氨酸蛋白酶方面有着丰富的经验。他们认为自己处于成功的有利位置。然而，他们对高通量筛选结果却感到有些惊讶和非常失望：通过筛选他们公司的400万种化合物的化合物库并没有发现任何可行的先导化合物，他们完全空手而归。

在没有任何先导化合物作为起点的情况下，先灵葆雅决定采用基于结构的药物设计方法。与BI相反，先灵葆雅以十一肽（一种含11个氨基酸的肽）形式的蛋白酶底物作为其起点。对于蛋白酶抑制剂来说，醛、三氟甲基酮、硼酸、氟酮、酮杂环、酮酸和酮酰胺是众所周知的“弹头”，可作为酶的可逆转亲电阱。

在乙醛和三氟甲基酮弹头未能奏效后，先灵葆雅选择酮酰胺作为弹头，与酶的天然底物相结合。在十一肽上安装了一个酮酰胺弹头作为亲电阱，它将在催化丝氨酸-139和活化的羰基部分之间形成共价键。酮酰胺弹头将成为波普瑞韦和特拉匹韦的标志。十一肽不适合成为药物，因为肽不容易被吸收，但会被快速代谢水解为单个氨基酸结构单元并失去其活性。通过细致和系统的工程来降低分子量和修饰每个氨基酸，人们发现了具有较高口服生物利用度的波普瑞韦[4]。

波普瑞韦（boceprevir，Victrelis）在2011年获得FDA批准后，先灵葆雅/默克公司不断优化其酮酰胺NS3/4A抑制剂系列。其中一种那拉瑞韦（narlaprevir）的效力是波普瑞韦的10倍。该药物于2016年在俄罗斯获批，默克公司以商品名Arlansa销售。

2011年5月，先灵葆雅的波普瑞韦获得FDA批准，10天后，Vertex的NS3抑制剂特拉匹韦（Incivek）获得FDA批准。波普瑞韦有一个类似的酮酰胺弹头作为亲电阱。

早在1993年，Vertex就通过与当时只是华盛顿大学助理教授的Charles Rice建立联系，开始对研究HCV产生了兴趣。Vertex研究HCV的理由之一是，该公司已经从他们研究HIV蛋白酶的经验中熟悉了蛋白酶。1996年夏天，Vertex成功培育出他们的第一个HCV NS3蛋白酶衍射级晶体。这种酶的表面非常光滑，缺少常见的裂缝，没有导致结合位点被埋在口袋里的常见的裂缝。

来自先灵葆雅的病毒学家Ann Kwong于1997年加入Vertex，并带来了丰富的HCV生物学经验。与此同时，Vertex开始与礼来合作开发HCV NS3蛋白酶，礼来出资5000万美元。礼来针对NS3蛋白酶对他们的整个化合物管理库进行了筛选，结果也向先灵葆雅那样，完全空手而归。这让他们别无选择，只能像先灵葆雅一样追求基于结构的药物设计方法。

由Roger Tung领导的Vertex化学家设计了新的支架和弹头。他们使用BI公开的六肽支架作为起点，最初安装了醛弹头没有成功，但与先灵葆雅相同的酮酰胺弹头被证明是可行的。这次合作最终导致了特拉匹韦的发现[2]。

礼来的工艺化学家对该药的理化性质感到震惊。它太大，太油腻，太不溶。高度结晶的特拉匹韦具有与砖粉一样的溶解度。此外，仅生产1公斤这种药物就花费了250万美元，需要22个步骤，其中许多步骤的产量非常低。最终，礼来决定停止与Vertex在该项目上的合作。

但礼来的不信任票并不影响Vertex对该化合物的信心。他们的信心来源之一是药物优先分布到肝脏。临床试验于2004年开始，尽管该公司在Ib期试验期间仍在努力用聚合物将药物配制成无定形形式，以增强其溶解度。在II期试验期间，Vertex与强生旗下的Tibotec签署了共同开发协议，这家制药巨头支付了所有开发成本，并向较小的生物技术合作伙伴支付了近5亿美元的合并里程碑付款[5]。

波普瑞韦和特拉匹韦于2011年获批，成为首个治疗丙肝的直接作用抗病毒药物，标志着治疗范式进入新纪元。Vertex 公司的特拉匹韦在短短6个多月的时间内，成为累计销售额达到10亿美元的最快药物。有趣的是，许多更好的HCV药物很快就在市场上紧随其后。截至2014年底，Vertex宣布，出于财务考虑，将停止特拉匹韦在美国的销售和分销。差不多在同一时间，同样的命运也发生在了先灵葆雅的波普瑞韦身上。

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HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂

大环可逆的NS3/4A抑制剂

BI的西鲁普韦和法达瑞韦为随后所有NS3/4A抑制剂的成功奠定了基础。而且，西鲁普韦和法达瑞韦的化学型成为“me-too”药物的原型，利用其药效团，通过简单的修饰来最大限度地降低毒性和增强药效，从而制造出成功的药物。

利用BI的大环NS3/4A抑制剂法达瑞韦，Medivir/Janssen于2013年率先获得FDA批准的大环可逆性NS3/4A抑制剂司美匹韦（simeprevir）。司美匹韦有几个特点与法达瑞韦不同。项目一开始，瑞典Huddinge的Medivir决定使用环戊烷（⌂）为核心结构来替代原型西鲁普韦的脯氨酸核心，毫无疑问，这完全是出于对代谢更强劲的支架的渴望。

位于爱尔兰的Janssen子公司Tibotec与Medivir合作，采用酰基磺酰胺作为羧酸的生物等排体。他们将环丙基（Δ）酰基磺酰胺部分鉴别为保留酸性元素的结构基序，与西鲁普韦和法达瑞韦上存在的简单环丙基羧酸类似物相比，效力增强高达1000倍。这并不奇怪，所有的“me-too”NS3/4A抑制剂都包含这种神奇的环丙基酰基磺酰胺基序。

最终，Medivir/Tibotec/Janssen的司美匹韦（Olysio）于2013年获批。与之前批准的两种NS3/4A抑制剂特拉匹韦和波普瑞韦缓慢可逆的共价抑制剂相比，司美匹韦（Olysio）是一种普通可逆的NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂，所有后续的“me-too”药物也是如此[6]。

下面显示了一个命名法，以便更好地了解蛋白酶和蛋白酶抑制剂。从本质上讲，蛋白酶通常在酶的活性位点有催化金属离子，例如Zn++。任意定义活性金属离子左侧的第一个结合口袋为S1，左侧的第二个结合口袋为S2，以此类推。催化金属右侧的第一个结合口袋被定义为S1′，右侧的第二个结合口袋被定义为S2′。对于以肽链形式存在的内源性配体，将占据S1口袋的片段定义为P1区域。同时，占据S1′口袋的肽片段被称为P1′区域。

典型的例子是BI的西鲁普韦。其大环由P1–P3区形成，Janssen的司美匹韦和罗氏的达诺瑞韦也是如此（Ganovo，罗氏，2013年，仅在中国）。另一方面，所有后续可逆HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂均为P2–P4大环化合物。包括默克的伐尼瑞韦（vaniprevir，Vanihep，2014，仅在日本）、格拉瑞韦（grazoprevir，Zepatier，与NS5A抑制剂艾尔巴司韦联用，2016）和那拉瑞韦（narlaprevir，Arlansa，2016，仅在俄罗斯）；Abbvie的格卡瑞韦（glecaprevir，Mavyret，与NS5A抑制剂哌仑他韦联用，2017）和吉利德的伏西瑞韦（voxilaprevir，Vosevi，与索非布韦和雷迪帕韦联用，2017）。

例如，伏西瑞韦与HCV NS3/4A蛋白酶Ser-His-Asp（S139、H57和D81）催化三联体具有良好的结合相互作用，该催化三联体在所有基因型和R155中都是保守的，因此对基因型3和基因型1抗性相关替换具有皮摩尔效力。Vosevi为既往直接作用抗病毒药物治疗失败的最难治愈患者提供了一种治疗选择。对于直接作用抗病毒初治患者，Vosevi提供了一种将治疗时间缩短至8周的泛基因型选择。考虑到HCV有8种基因型和至少86种病毒亚型，泛基因型药物是治愈的理想选择[6]。

BMS的阿舒瑞韦与勃林格殷格翰的法达瑞韦密切相关，是一种上市的无环可逆HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂。令人遗憾的是，阿舒瑞韦的处方标签上有肝毒性警告。所有这些药物作为聚乙二醇干扰素/利巴韦林或具有互补机制的直接作用抗病毒药物联合治疗的一部分，在HCV感染的治疗中具有相当大的潜力。

已上市的HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂如下：

●　波普瑞韦（Boceprevir,Victrelis, Schering-Plough/Merck）2011年05月13日

●　特拉匹韦（Telaprevir,Incivek,Vertex）2011年05月23日

●　司美匹韦（Simeprevir,Olysio,Tibotec/Medivir/Janssen）2013年

●　达诺瑞韦（Danoprevir,Ganovo, Roche）2013年，中国

●　阿舒瑞韦（Asunaprevir,Sunvepra,BMS）2014年

●　伐尼瑞韦（Vaniprevir,Vanihep,Merck）2014年,日本

●　格拉瑞韦（Grazoprevir,Zepatier的一种成分，与NS5A抑制剂艾尔巴司韦联用, Merck）2016年

●　那拉瑞韦（Narlaprevir,Arlansa,Schering-Plough/Merck）2016年，俄罗斯

●　格卡瑞韦（Glecaprevir,Mavyret的一种成分，与NS5A抑制剂哌仑他韦联用, Abbvie）2017年

●　伏西瑞韦（VoxilaprevirVosevi的一种成分，与索非布韦和雷迪帕韦联用, Gilead）2017年