治疗艾滋病的HIV蛋白酶抑制剂

五类蛋白酶抑制剂系列：

治疗高血压的ACE抑制剂

 治疗糖尿病的DPP-4抑制剂

治疗艾滋病的HIV蛋白酶抑制剂

治疗HCV的HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂

治疗新冠肺炎的3CL蛋白酶抑制剂

其他人类天冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶、胃泌素和组织蛋白酶。HIV蛋白酶是由单体亚基对称二聚形成的，每个亚基都有一个催化的天冬氨酸残基。因此，许多制药公司最初筛选他们的老肾素抑制剂(用于调节血压)来寻找HIV蛋白酶抑制剂就不足为奇了。蛋白酶抑制剂看的设计明显促进了X射线晶体结构的可用性，允许直接观察结合到酶的抑制剂。

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第一代HIV蛋白酶抑制剂

罗氏的沙奎那韦(saquinavir, Invirase)是美国市场上第一个HIV蛋白酶抑制剂。早在1986年，罗氏就开展了一项雄心勃勃的国际合作，以解决HIV蛋白酶的问题。

由Ian Duncan和Sally Redshaw领导的在英国Welwyn的一个化学小组，在选择比色分析法作为体外试验后，使用“过渡态模拟”策略设计抑制剂，这种策略之前在生产强效肾素抑制剂方面非常成功。由于反应的过渡态具有最高的反应热力学能量，因此，过渡态模拟物能够抑制酶的功能。

沙奎那韦依赖于羟基部分作为四面体过渡态的等构体，这一设计元素源于对肾素抑制剂的广泛探索，肾素是另一种哺乳动物天冬氨酸蛋白酶。化学家们很快取得了一个重要的里程碑式结果：通过定义最小的模拟肽，达到可以实现接受的抑制水平。他们发现，三肽在效力和生物利用度方面都是理想的。因此，三肽成为许多蛋白酶抑制剂共同遵循的主题。

罗氏团队在微调三肽方面做出了巨大的努力，通过逐个修饰每个氨基酸残基，系统地探索了他们的先导化合物。他们的辛勤工作在1991年得到了回报，沙奎那韦在1995年12月获得FDA批准，成为市场上第一种用于治疗艾滋病的HIV蛋白酶抑制剂。

虽然沙奎那韦是一种拟肽药，很容易就能被代谢掉，但后来发现它与另一种蛋白酶抑制剂利托那韦作为药物增强剂共同使用更有益。由于利托那韦抑制了肝脏中降解沙奎那韦的细胞色素P450 3A4(CYP3A4)酶，因此两种药物联合使用可以显著提高沙奎那韦的血浆水平。CYP3A4是肝脏中含量最丰富的CYP同工酶。此外，沙奎那韦的出现标志着将蛋白酶抑制剂引入临床的鸡尾酒药物组合疗法的开始。^[1]

雅培的利托那韦(ritonavir, Norvir)是市场上第二种蛋白酶抑制剂。利托那韦被发现的环境非常独特。雅培团队由X射线晶体学家John Erickson和药物化学家Dale Kempf领导。据传默克有30名化学家参与他们的HIV蛋白酶抑制剂项目，而Kempf只有3名。

雅培没有像大多数制药公司那样筛选他们的肾素抑制剂，而是利用了Erickson对HIV蛋白酶的X射线晶体学的研究，这将被证明对他们的药物设计有帮助。结合基于结构的药物设计(SBDD)和传统的药物化学，他们制备了一系列基于对称性的抑制剂，以匹配HIV蛋白酶的C2-对称性质。

因为他们的抑制剂结合到了酶的两侧, Kempf将它们称为分子花生酱(molecular peanut butter)。通过这种方法，他们找到了含有吡啶的四肽A-77003。虽然A-77003在结合和细胞试验中是有效的，但它有极高的人类胆道清除率。通过降低分子量和用更可溶性的氨基酸取代现有的氨基酸，他们实现了生物利用度的提高。 

最终发现，吡啶末端被肝细胞色素P450氧化为N-氧化物。简单地用代谢更强的噻唑取代吡啶，并进行一些微调。利托那韦的生物利用度为78%，而吡啶模拟物A-77003的生物利用度为26%。1996年3月，雅培的利托那韦获得了FDA的批准。^[2]

雅培发现利托那韦无疑令人印象深刻。但发现它之后的两件事，一样有趣。其中一项涉及它的晶体形态，另一项涉及吉利德发现的利托那韦类似物cobicistat，用作生物利用度增强剂。

1996年，雅培的利托那韦获得了FDA批准，并以商品名Norvir进行销售之后，使用原始结晶I生产了该药物的活性药物成分(API)。由于利托那韦在固体状态下没有生物利用度，所以它被制为口服溶液或半固体胶囊，都是在乙醇-水溶液中。 

1998年初，利托韦那上市两年后，原料药的生产开始出现问题：许多批次开始变成一种新的、不同的、极难溶解的晶体形式II，尽管晶体形式I最开始也很难溶。新的晶体形式II有一个广泛的分子间氢键网络，它在热力学上比原来的I更稳定。一旦有了II的晶体种子，无论它是多么细小和微观，大自然总是会把API转换成热力学上更稳定的晶型II。

一组接触过晶体II的科学家参观了雅培在意大利的制造工厂，调查了利托那韦的批量生产过程。后来，在工厂的生产过程中，大量的晶型II开始出现在原料药的生产过程中。这种情况确实让雅培陷入了营销危机。雅培的制药化学家们费尽心思才想出了一种只生产原始剂型I的方法：为了防止剂型II的形成，半固态胶囊或口服剂型在使用前需要冷藏等措施。^[3]

利托那韦成功后的另一个故事发生在加州Foster City的吉利德。有趣的是，当许多其他蛋白酶抑制剂被CYP3A4代谢时，利托那韦基于将药物运送到细胞外这一机制，有效地抑制了CYP3A4和P-糖蛋白(Pgp)。因此，它可以与CYP3A4蛋白酶抑制剂或其他药物共同使用，增加血浆水平。

因此，双蛋白酶抑制剂在疗效和降低耐药性方面已证明是强有效的治疗方案。低剂量利托那韦现在主要用作HIV抑制剂的药代动力学(PK)增强剂，也被称为药物增强剂。药物增强剂是一种本身通常对治疗靶点不具活性，但可以抑制使活性药物代谢的酶。因此，药物增强剂可以改善抗病毒药物的PK谱，以更低的剂量和更少的次数达到足够的谷浓度(药物在下一次给药前所达到的最低浓度)。

吉利德与日本Tobacco公司合作开发了HIV整合酶抑制剂挨替拉韦(elvitegravir，Vitekta, 2014)。遗憾的是，尽管挨替拉韦是一种有效的整合酶链转移抑制剂(INSTI)，但它在肝脏和肠道中被CYP3A4广泛代谢，不可能进行一天一次的治疗。尽管使用亚治疗剂量的利托那韦有可能引起对其他蛋白酶抑制剂的耐药性，但当与利托那韦一起给药时，出现了较好的药物暴露增加。

因此吉利德决定生产一种只能通过抑制CYP3A4介导的代谢来提高生物利用度，但完全不抑制HIV蛋白酶的药物；同时，高水溶性和良好的理化性质也有利于进行药物制备。虽然利托那韦的水溶性较差，但在药物化学负责人Manoj Desai的领导下，由Lianhong Xu领导的团队以利托那韦为起点，研究出了一种有效的、口服生物利用度高的选择性CYP3A4抑制剂cobicistat。

科学家们敲掉了利托那韦上的一个羟基，因为它模拟了酰胺水解的过渡状态：通过与HIV蛋白酶活性位点催化域的两个氨基酸形成氢键，而没有关键羟基的分子几乎无法与HIV蛋白酶结合。Cobicistat于2012年获得FDA批准，吉利德将其以Tybost的商品名出售，已与多种抗逆转录病毒药物联合使用。^[4]

在药物发现中，当两种药物被相同的肝脏CYP酶代谢时，就会发生药物-药物相互作用(DDI)。它们通常有充分的理由被认为是一种“负债”。例如，拜耳的他汀类药物cerivastatin (Baycol)在与降低胆固醇的纤维类药物一起服用时，会导致严重的肝损伤。因为这两种药物都是由CYP3A4代谢，肝脏却没有足够的CYP3A4酶来同时代谢这两种药物，从而就会产生毒性。

但有了利托那韦和cobicistat这样的药物增强剂，我们可以把药物的“负债”变成“资产”。当药物增强剂使肝脏的CYP酶忙碌时，抗病毒药物可以专注于杀死病毒，而不用提防自己。Cobicistat可以使每日一次的含蛋白酶抑制剂的单片治疗成为可能。

默克的茚地那韦(indinavir, Crixivan)是市场上第三个蛋白酶抑制剂。默克于1986年开始了对HIV蛋白酶抑制剂的研究，当时分子生物学部门的高级主任Irving Sigal是该项目的带头人。他们最初也筛选了肾素抑制剂对HIV蛋白酶的抑制作用，然后利用已知的HIV蛋白酶晶体结构进行合理的药物设计，该晶体结构由默克首先发现，NIH的科学家优化。

1990年，化学家Wayne Thompson发现了L-689,502，它能有效抑制HIV蛋白酶，但缺乏肾素活性。然而，它只有注射才有效，没有生物可利用性。随后，受到文献中可行的口服药物沙奎那韦启发，Joseph Vacca成功地将沙奎那韦的一个片段植入了L-689,502。 

1989年，Vacca团队的新员工Bruce Dorsey和他的同事Rhonda Levin成功合成了茚地那韦。虽然在单药治疗试验中，大约40%的患者在服用该药6个月后，RNA低于400拷贝/毫升，但在一些患者中，HIV病毒对茚地那韦产生了耐药性。幸运的是，他们发现，茚地那韦和AZT或拉米夫定(Epivir)结合能够非常有效地抑制病毒水平。

默克对联合疗法的研究率先证明了鸡尾酒疗法的疗效，并成为业界标准。茚地那韦在1996年1月向FDA提交申请后，于1996年3月在加速审查过程中获得批准。^[5]

其他重要的早期蛋白酶抑制剂包括Agouron(现辉瑞)的奈非那韦(nelfinavir, Viracept, 1997年3月获批)和Vertex的amprenavir(Agenerase, 1999年4月批准)。这些统称为第一代蛋白酶抑制剂。

Vertex公司在蛋白酶抑制剂领域起步较晚。借助晶体学和计算机辅助药物设计，Vertex和他们在Kissei公司的日本合作者发现了amprenavir，这是一种非常有效的皮摩尔HIV蛋白酶抑制剂。

1993年，Vertex与Burroughs Wellcome合作，研究Kissei公司的amprenavir的PK特性。被AZT的成功冲昏头脑的Burroughs Wellcome在蛋白酶抑制剂领域起步较晚，需要借助Kissei/Vertex的药物作为跳板。Amprenavir足够小，足以穿透血脑屏障，杀死其中的病毒。显然，他们对这一结果很满意，Burroughs Wellcome关闭了自己的HIV蛋白酶项目，并同意支付Vertex 2亿美元药物临床试验费用。 

Amprenavir于1999年获得FDA批准，Vertex和Burroughs Wellcome(1995年更名为Glaxo Wellcome, 2000年更名为Glaxo SmithKline)联合销售该药物，商品名为Agenerase。该药物尽管具有100%的生物利用度，但后来因其水溶性较差(0.04 g/mL)而停止使用。

它需要较高的赋形剂与药物的比例，来保证胃肠道的溶解度和最终的吸收。Vertex继续制备其磷酸酯前药福沙那韦(fosamprenavir)，其水溶液溶解度增加了8倍(0.31 g/mL)。前药福沙那韦于2005年获得批准，Vertex和GSK将其以Lexva的商品名进行出售。

蛋白酶抑制剂可能是抗逆转录病毒类中最有效的，一部分原因是它们通常具有较高的耐药性基因屏障。早期使用的第一代蛋白酶抑制剂沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦并没有利用对CYP3A4抑制的促进作用。

尽管如此，这些抑制剂的药代动力学特性并不理想。尽管具有很高的遗传障碍，但这些第一代蛋白酶抑制剂最终确实出现了耐药性。后来，利托那韦提供的药代动力学增强使得给药频率降低，许多药物可以每天给药一次，而且由于每日血浆谷浓度大大提高，耐药性的遗传屏障更高。 

最新的HIV蛋白酶抑制剂是Janssen公司的达芦那韦(darunavir, Prezista)，于2006年获得FDA批准。Arun Ghosh发现达芦那韦的经历是一段漫长而曲折的旅程。

1988年，Ghosh在哈佛大学完成了E.J. Corey的博士后培训后，在默克位于宾夕法尼亚州West Point的基地工作了6年，参与了HIV蛋白酶抑制剂的发现。但在1994年，他决定在伊利诺伊州立大学的芝加哥分校开始他的学术生涯，2005年前往普渡大学。

为了更好的发现HIV蛋白酶抑制剂，Ghosh采用了“骨架结合”的设计概念，以最大限度地与HIV蛋白酶的活性位点相互作用，特别是促进与蛋白质主干原子的广泛氢键。他的团队最初在罗氏的沙奎那韦上安装了一个四氢呋喃(THF)环。后来，通过结合默克茚地那韦的左旋特性，Ghosh得到了一种非常好的含有四氢呋喃的蛋白酶抑制剂。

沙奎那韦(saquinavir, Invirase, Roche)，1995

茚地那韦(indinavir, Crixivan, Merck)，1996

利托那韦(ritonavir, Norvir, Abbott), 1996

nelfinavir (Viracept, Agouron/Eli Lilly)，1997

amprenavir (Agenerase, Vertex/GSK，停产)，1999-2008年

洛匹那韦(lopinavir, Kaletra与利托那韦，雅培)，2000

阿扎那韦(atazanavir, Reyataz, Ciba Geigy)，2003

福沙那韦(fosamprenavir, amprenavir的前药，lexva, GSK/Vertex)，2005

替普那韦(tipranavir，Aptivus, Upjohn/Pfizer/Boehringer Ingelheim)，2005

达芦那韦(darunavir, Prezista, Janssen)，2006