图1：ARV-110和ARV-471
最为大家所知的PROTACs是Arvinas的AR和ER口服PROTACs药物bavdegalutamid（ARV-110）和ARV-471。
在临床试验中，唯一没有使用cereblon E3配体的PROTAC是Dialectic Therapeutics的DT-2216，它使用了VHL链接酶配体，目前在二期临床试验中，给药方式为静脉注射。
Kymera在他们的IRAK4 PROTACs中也使用了cereblon E3配体，但请注意他们使用了新型专有配体，这正是本综述的主题。
图2：DT-2216与Kymera的IRAK4 PROTAC
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泛素-蛋白酶体系统（UPS）
图3：泛素-蛋白酶体系统
泛素-蛋白酶体系统(UPS)对蛋白质稳态至关重要，并与许多细胞活动有关。泛素是一种由76个氨基酸组成的蛋白质，泛素标记的细胞蛋白会被被ATP依赖的26S蛋白酶体降解。
泛素化级联反应始于ATP结合的泛素激活酶(E1)激活泛素分子，并形成泛素-AMP作为中间产物和泛素-E1硫酯作为最终产物；随后，硫酯键转移到泛素结合蛋白或泛素载体蛋白(E2)上；最后，泛素通过泛素连接酶(E3)从E2转移到目标蛋白的赖氨酸残基上。
E2酶以特定方式与E3酶结合，但每个E2酶可以结合多个E3酶。E3酶直接与蛋白质底物相结合，在此基础上，E2酶才能够将泛素亚基转移到靶蛋白上。因此，是E3酶决定了最终对靶蛋白的选择性和特异性。[1]
人类基因组编码的E1激活酶只有2种，，E2酶约为40种，而E3链接酶多达600多种。
第一波应用最为广泛的小分子非肽配体主要靶向包括cereblon (CRBN)、von Hippel-Lindau蛋白(VHL)和细胞凋亡蛋白抑制剂(cIAP)在内的E3酶，CRBN和VHL配体一直是PROTAC配体中的主力。随后PROTAC连接酶的选择范围逐渐扩展到MDM2、DDB1、DCAF15以及KEAP1。最新的研究开始针对更广泛的E3连接酶配体，包括DCAF16、RNF4、RNF114、SOCS2、UBR2、KLHL3、TRIM和AhR等。[2]
具有讽刺意味的是，尽管人类已知的E3泛素连接酶大约有600种，但能通过小分子配体在PROTAC种成功靶向的E3酶还不到10种。
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Cereblon E3 泛素连接酶配体
图4：沙利度胺及其他免疫调节剂的作用机理
沙利度胺于1958年上市，用于治疗孕吐。不幸的是，作为一种强致畸剂，它在全球引起了严重出生缺陷。
2010年，作为DDBI-CRBN E3泛素连接酶复合物的一个组成部分，cereblon (CRBN)被发现是沙利度胺和相关免疫调节药物，如来那度胺和泊马度胺的主要分子靶点。[3]
几年后，对IKAROS家族转录因子（包括IKZF1、IKZF3）的结构研究表明，这些免疫调节药物调控泛素对IKAROS家族转录因子的结合和靶向。IKZF1/3本身并不是CRBN的底物，但这些免疫调节药物使他们成为了CRBN的新底物（neo-substrate）。[4]
这些见解，再加上沙利度胺与类似物来那度胺和泊马度胺的不同之处在于单一的C-4苯胺取代[4]，提供了一条清晰的途径来缀合新的配体，以实现基于邻近的蛋白质降解。因此，这些免疫调节药物也被称为分子胶。
图5：Avadomide及TD-106
其他E3 cereblon连接酶配体包括avadomide (CC-122)和TD-106。[5]这些免疫调节药物通过降解包括IKZF1/3在内的底物来有效治疗多发性骨髓瘤。
Celgene（现为BMS）在cereblon介导的蛋白质降解领域取得了长足的进步。除了市场上的来那度胺和泊马度胺外，他们还开发了iberdomide（CC-220）、mezigdomide（CC-92480）作为cereblon E3连接酶调节药物（CELMoD）。这两个化合物目前都处于治疗多发性骨髓瘤的 II 期临床试验中。有趣的是，CC-885的靶蛋白是G到S相变蛋白1 (GSPT1)。[6]
在2022年4月的AACR上，C4 Therapeutics透露了他们的选择性IKZF1/3降解剂CFT7455在临床I期的实验结果。它显然是iberdomide (CC-220)的类似物，具有皮摩尔级别的IC50和DC50值。遗憾的是，它显示出靶点相关的剂量依赖性毒性（中性粒细胞减少症），因此导致其股价暴跌。
图6：CC-225, CC-92480, CC-885和CFT7455
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有专利性的新型Cereblon E3泛素连接酶配体
图7：CRBN介导的蛋白质降解
沙利度胺由两种酰亚胺组成：左侧的邻苯二甲酰亚胺和右侧的戊二酰亚胺。尽管它是目前最广泛使用的E3配体，但沙利度胺在生理条件下会被缓慢水解。此外，沙利度胺作为一种分子胶，会募集IKZF1和GSPT1等底物，已在很多PROTAC上证明会导致免疫相关的脱靶效应。
因此，已有大量研究尝试通过骨架跃迁策略替代两个酰亚胺或者其中之一，以获得更好的配体和/或获得新的知识产权。
图8：沙利度胺结构
早在2019年，韩国的一个研究小组就报道了一种新型cereblon配体TD-106，用于基于免疫调节药物的靶向蛋白质降解。他们制备了所有四种可能的氨基苯并三嗪基戊二酰亚胺。其中TD-106诱导IKZF1/3的降解活性与泊马度胺相当，而其他三种类似物没有显示出降解活性。由BET抑制剂JQ1和TD-106组成的PROTAC，可有效诱导前列腺癌细胞系22Rv1中的BET蛋白降解。[5]
图9：韩国研究小组的尝试
Rankovic团队则报道了苯基戊二酰亚胺作为另一种cereblon配体来组装PROTAC。苯基戊二酰亚胺保留了对cereblon的亲和力，高配体效率(LE > 0.48)，并显示出可改进的化学稳定性。使用苯基戊二酰亚胺作为cereblon E3连接酶配体与 JQ1连接的PROTAC是一种独特有效的BET蛋白降解剂，并在低皮摩尔浓度下抑制人急性髓细胞白血病MV4-11细胞的活性。[7]
此外，使用苯基戊二酰亚胺作为新型cereblon配体还可得到强效和选择性的JAK2/3降解剂，如下所示的SJ10542所示。[8]
图10：SJ10542的结构
为了改进现有的E3 cereblon连接酶配体，许多先驱公司已经通过对沙利度胺的骨架跃迁发现了新的配体。这里我们简要介绍五家公司的情况。[9]
3.1 C4 Therapeutics
C4 Therapeutics是最早探索优质和新型cereblon E3连接酶配体的公司之一。2017年，他们公开了可用于靶蛋白降解的C3-碳连接的戊二酰亚胺降解剂和胺连接的C3-戊二酰亚胺降解剂，如下所示。降解决定子包括磺酰胺基-戊二酰亚胺和杂芳基戊二酰亚胺。[10,11]
图11：C3-碳连接的戊二酰亚胺降解剂和胺连接的C3-戊二酰亚胺降解剂
2018年，C4进一步声称N/O-连接的降解决定子和降解剂可用于蛋白质降解，如下所示。[12]
图12：N/O连接的降解决定子和降解剂
与Rankovic团队发现的苯基戊二酰亚胺类似，这些PROTAC分子使用N-连接降解决定子，与BET抑制剂JQ1组成蛋白降解剂，实现了对目标蛋白质BET的降解。[12]有趣的是，在2022年4月的AACR会议上披露的具有口服生物利用度的BRD9降解剂CFT8634也使用了同类的降解决定子。
图13：CFT8634的结构
C4 Therapeutics报道的其他工作如下所示：[13,14]
图14：C4 Therapeutics 的其他CRBN配体
2019年，C4 Therapeutics申请了一系列独特的对cereblon具有高亲和力的螺环戊二酰亚胺衍生物和琥珀酰亚胺/海因衍生物的专利。[15]
3.2 Arvinas
作为PROTAC领域的先驱，Arvinas也拥有其专有的cereblon配体专利。如下图所示，Arvinas 的化合物包括杂芳基戊二酰亚胺和开链N取代的尿嘧啶。这些化合物对cereblon蛋白的亲和力由表面等离子共振(SPR)评价。[16]
图15：Arvinas的CRBN配体专利结构
3.3 Kymera
Kymera专利公开了与戊二酰亚胺相连的三环和双环结构 [17]，以及N-取代的喹唑啉二酮等结构。[18]
图16：Kymera的CRBN配体专利结构
以下是两个使用了Kymera独特cereblon配体的IRAK PROTAC分子。
图17：Kymera的PROTAC结构
3.4 Foghorn
Foghorn的专利涵盖了不同的杂芳基戊二酰亚胺和2-哌啶酮-N-取代的戊二酰亚胺。[19]
图18：Foghorn的CRBN配体专利结构
3.5 Vividion
更令人兴奋的是，共价cereblon配体已经获得了一定的关注。在此前提下成立的公司Vividion与斯克里普斯研究所的Ben Cravatt教授合作开发了一系列共价cereblon配体。下面展示了几个示例。[20]
去年9月，拜耳以15亿美元收购了Vividion。
图20：Vividion的共价CRBN配体
综上所述，骨架跃迁是设计有专利性的cereblon E3泛素连接酶配体的有效策略。
这些在靶向蛋白质降解领域的先驱生物技术公司如今都价值数十亿美元，部分归功于他们的新型E3配体。因此，有理由说：知识就是力量！
References:
1. LaPlante, G.; Zhang, W. Targeting the Ubiquitin-Proteasome System for Cancer Therapeutics by Small-Molecule Inhibitors. Cancers 2021, 13, 3079.
2. Ishida, T.; Ciulli, A. E3 Ligase Ligands for PROTACs: How They were Found and how to Discover New Ones. SLAS Discov. 2021, 26, 484–502.
3. Ito, T. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science 2010, 327, 1345–1350.
4. Fischer, E. S. et al., Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature 2014, 512, 49–53.
5. Hwang, J. Y. A novel cereblon modulator for targeted protein degradation. Eur. J. Med. Chem. 2019, 166, 65–74.
6. Chamberlain, P. P. Evolution of Cereblon-Mediated Protein Degradation as a Therapeutic Modality ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 1592–1602.
7. Rankovic, Z. Phenyl-Glutarimides: Alternative Cereblon Binders for the Design of PROTACs. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 26663–26670.
8. Rankovic, Z. Development of Potent and Selective Janus Kinase 2/3 Directing PG−PROTACs. Am. Chem. Soc. Med. Chem. Lett. 2021, 13, 475–482.
9. Kazantsev, A.; Krasavin, M. Ligands for cereblon: 2017–2021 patent overview. Exp. Opin. Ther. Pat. 2022, 32, 171–190.
10. Phillips, A. J. Amine-linked C3- glutarimide degronimers for target protein degradation. WO 2017197051 (2017).
11. Phillips, A.; Nasveschuk, C.; Henderson, J.; Liang, Y.; He, M.; Lazarski, K.; Veits, G.; Vora, H. C3-Carbon linked glutarimide degronimers for target protein degradation. WO2017197046A1 (2017).
12. Phillips, A. J. N/O-Linked degrons and degronimers for protein degradation. WO2018237026. (2018)
13. Phillips, A. J. Degraders and degrons for targeted protein degradation. WO 2019099868 (2019).
14. Nasveschuk, C.; Zeid, R.; Yin, N.; Jackson, K. L.; Veits, G. K.; Moustakim, M.; Yap; J. L. Compounds for targeted degradation of BRD9. WO2021178920A1 (2021).
15. Nasveschuk, C. G.; Dey, F.; Goergler, A.; et al. Spirocyclic compounds. WO 2019204354. (2020).
16. Crew, A.; P.; Berlin, M.; Dong, H.; et al. Cereblon ligands and bifunctional compounds comprising the same. US 20180215731 (2018).
17. Mainolfi, N. IRAK degraders and uses thereof. WO 2019140387 (2019).
18. Mainolfi, N. IRAK degraders and uses thereof. WO 2020113233 (2020).
19. Ruppel, S. K. WO 2020160196 (2020).
20. Cravatt, B. F.; Stamos, D. Cereblon modulators and uses thereof. US20200206201 (2020).
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