每棵巨大的苹果树都是从一粒小小的苹果种子开始的。用于拯救生命的药物的发现则是从苗头化合物（Hits）或者先导化合物（Leads）开始的。
在小分子药物开发项目中的药物化学部分，我们最开始通常需要一个化学结构作为起点，也就是苗头化合物或者先导化合物。那么它们究竟是从哪里来的呢？它们的主要来源包括（i）非理性的药物设计（偶然发现）；（ii）天然产物；（iii）高通量筛选（HTS）；（iv）基于片段的药物发现（FBDD）；（v）DNA-编码化合物库（DEL）；等。
对于今天的药物化学家来说，这是一个激动人心的时代。许多技术的进步使我们能够更容易地发现苗头化合物，尤其是对于那些非常有挑战性的“不可成药”靶点。本文简要介绍一种相对较新但非常有效的药物发现策略：基于片段的药物发现（FBDD），又称为基于骨架的药物设计。
截止到2021年底已经有六个基于片段衍生的药物被美国FDA批准上市，印证了FBDD在药物发现方面的威力（图1）。这六个药物分别是Plexxikon公司的B-RafV660E抑制剂vemurafenib（1）和CSF1R & KIT抑制剂pexidartinib（2）；艾伯维公司的Bcl-2抑制剂venetoclax（3）；Astex公司的FGFR3抑制剂erdafitinib（4）；安进公司的KRASG12C抑制剂sotorasib（5）以及诺华公司的Bcr-Abl-1变构抑制剂asciminib（6）。值得注意的是，除了艾伯维公司的Bcl-2抑制剂venetoclax（3）是以蛋白–蛋白相互作用作为靶点外，市场上其他五个药物都是以蛋白激酶作为靶点FBDD的确在蛋白激酶抑制剂的发现上富有成效。【1】
图1：基于片段衍生批准上市的药物
已经有数十种基于片段衍生的药物进入II期临床试验，还有更多的处在I期临床试验阶段。
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介绍
与高通量筛选（HTS）的化合物库集不同，片段化合物库通常不是很大，数量从几十到数千不等。顾名思义片段通常是重原子数小于20的小分子（分子量在100–250之间）。片段的官能团数量较少，刚好大到能与目标蛋白形成足够的相互作用，又小到将不利的相互作用降到最低。通常片段与靶标的亲和力相对较弱，需要较高的暴露浓度（微摩尔至毫摩尔级别），因此检测片段与靶标片段的结合需要灵敏度较高的筛选方法——核磁共振（NMR）和表面等离子体共振（SPR）技术是检测直接结合的常用方法，此外通过浸泡方式的蛋白–配体X-射线晶体衍射方法在片段的发现中也有许多应用。由于这些生物物理方法只能检测结合，因此还需要一个正交试验来去除非特异性结合的片段。
图2：片段的特征
一旦发现片段，就需要通过基于结构的片段生长或者不同片段互相连接的方法对其进行仔细的结构优化，以提高片段与靶标的亲和力（图2）。片段生长的策略有很多种，其中片段连接是最常用的方法。由于片段结合的位置通常在靶标的活性位点附近，因此通过合适长度的连接链将两个片段连接起来组成一个更大的片段将可能得到一个亲和力更高的分子。但是，确定一个合适的连接链并不是那么容易，通常需要多次尝试。片段的演化是另一种常用的方法。这种方法通常是在片段分子上增加一些官能团，希望能在靶标的活性位点附近增加一些其它的相互作用。
FBDD对片段的要求与传统药物开发中的类药五规则（Rule of 5, Ro5）有些许不同。2003年Congreve等人在Astex公司提出了FBDD开发的三规则（Rule of 3，Ro3），又被称为“Astex Rule of Three”（Table 1）。【2】
Table 1. RO3 and RO5
值得注意的是，与传统筛选方法相比，FBDD筛选得到的苗头化合物活性相对较弱，需要在较高浓度下进行测试，这就会带来溶解度的问题，同时较高的浓度也可能会导致胶体的加速聚集，并且即使是低含量的杂质（如锌，EDTA）在高浓度情况下也会导致许多问题。
2016年出版了一本非常优秀的书，其中收录了FBDD各个方面的内容，在此不再赘述。【3】下面我们着重介绍一下FBDD的一些重要成就。
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X-Ray晶体学指导的FBDD
Plexxikon公司的vemurafenib（1）是第一个在共晶学指导下通过FBDD策略开发并上市的药物。2002年，B-RafV660E的等位突变逐渐被发现可以作为癌症治疗的靶点。由于B-RafV660E是当时已知最常见的致癌蛋白激酶突变，而且只存在于依赖RAF/MEK/ERK通路的肿瘤中，Plexxikon公司迅速跟进，开始针对这一靶点开发药物。以200 mM的化合物浓度高通量筛选一个由20000个片段化合物组成的化合物库（分子量介于150-350之间，氢键的供体和受体 < 8，可旋转键数较少），最终得到238个苗头化合物。7-氮杂吲哚（7）是其中之一，与PIM1激酶的共晶结构显示，它结合在该蛋白的ATP结合位点。同时，共晶显示3-苯胺-7-氮杂吲哚（8）同样可以与PIM1激酶结合，IC50大约为100 mM。化合物8的7-氮杂吲哚骨架代表了一种可以与激酶铰链区结合的通用框架片段，这一骨架通常可以与激酶的铰链区形成两个关键的氢键相互作用。通过一些微小的改动进一步得到了苄基-7-氮杂吲哚（9），共晶显示9可以与另一种蛋白FGFR1结合，并且对FGFR1的IC50为1.9 mM。
图3：PLX4720（10）的发现
进一步的构效关系研究得到了PLX4720（10）【4】，是一个高活性、高选择性（包括野生型B-Raf和很多其他激酶）的B-RafV660E抑制剂，IC50为13 nM（图3）。通过在10的7-氮杂吲哚母核上的5-位氯原子位置引入氯苯基就得到了vemurafenib（1）【5】。vemurafenib（1）对BRAF（31 nM）与c-RAF-1（48 nM）表现出类似的抑制活性，并且对其他激酶也有一定的选择性，包括野生型B-Raf（100 nM）。之所以选择vemurafenib（1）而不是10进一步开发，是因为它在比格犬和食蟹猴中的药代动力学性质更优。于是FDA于2011年批准vemurafenib（1）上市，用于BRAF突变的转移性黑色素瘤的治疗。【6】
图4：vemurafenib（1）的发现过程
图5：vemurafenib（1）与B-RafV660E的结合模式
Plexxikon实际上做到了一箭双雕。如下图所示，从7-氮杂吲哚（7）开始片段生长得到了苄基-7-氮杂吲哚（9），进一步生长得到的PLX647（11）恰好是一个CSF1R和c-KIT激酶的双重抑制剂。在PLX647的基础上再增加一个氯原子衍生出了第二个基于片段衍生开发上市的药物，pexidartinib（2）【7】（图6）
图6：pexidartinib（2）的发现过程
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X-Ray NMR指导的FBDD
艾伯维的venetoclax（3）是一个Bcl-2的抑制剂，同样是基于FBDD策略发现的。他们并没有使用共晶的方法，而是通过核磁共振（NMR）探索SAR的方法发现了他们的苗头化合物。最开始以1 mM的化合物浓度筛选了一个由10000个分子量小于215的片段库，发现对氟苯基苯甲酸（12，LE表示配体效率）结合于1号结合位点（P1）。接着他们以5 mM的化合物浓度筛选了一个由3500个分子量小于150的片段库，发现5,6,7,8-四氢萘-1-醇（13）是一个2号结合位点（P2）的配体分子（图7）。
图7：片段12和13的结构
使用酰基磺酰胺14作为羧酸的生物电子等排体，使其可以对右侧空间进一步延伸，得到占据蛋白3号结合位点（P3）的化合物15。然而遗憾的是15可以与人血清白蛋白-III（HSA-III）的结构域结合，因此在血清存在的情况下会导致化合物失活。对化合物15进行仔细的结构优化得到ABT-737（16），具有极性较大的氨基片段，从而降低了化合物与血清蛋白的结合。【8】
将16中的苯环用环己烯环代替提高了化合物的口服生物利用度，接着将可能存在风险的硝基苯结构替换，得到navitoclax（17）。Navitoclax是一个有效且可以口服的Bcl-2抑制剂，但是对Bcl-xL的选择性并不高，这也就导致它在临床上存在血小板减少等副作用，从而限制了它在临床上的剂量应用。【9】在17的基础上引入7-氮杂吲哚醚片段，其氮原子与蛋白4号结合位点（P4）104位精氨酸形成氢键相互作用，最终得到venetoclax（3），是一个高活性、高选择性（对Bcl-xL，Bcl-w和Bcl-1）并且可口服的Bcl-2抑制剂。2016年，美国FDA批准venetoclax（3）上市，用于治疗存在17p缺陷的慢性淋巴细胞白血病（CLL）。【10,11】（图8）
图8：venetoclax（3）的发现
片段结合的筛选还有许多其他的方法，例如表面等离子体共振（SPR），虚拟对接筛选（virtual docking screen）等，（图9）之后有机会可以单独些写一篇文章讨论。
更令人兴奋的是，现在已经建立了很多专门的片段库，用于发现表观遗传学靶点的苗头化合物。【12】 FBDD在RNA靶点的应用上也越来越受欢迎，【13】并且基于片段的共价配体的发现也已经在共价抑制剂的研发过程中做出了重要的贡献。【14】
图9：片段的筛选、确认以及生长中使用的方法
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总结
如今在苗头和先导化合物的发现过程中，FBDD已经成长为一个成熟且重要的工具。在构建片段库时，如果片段与靶标的相关性比较高，那么片段库的规模并不需要很大。
如果想要发现更新颖的苗头化合物，更新颖的片段分子是必需的。如果片段是多靶点的分子就更有利了。分子量小并且没有选择性的片段是最好的选择。例如，氮杂吲哚的片段已经在多个激酶抑制剂的发现过程中收获颇丰。
为了确认苗头化合物，需要多种生物物理方法交叉验证。SPR已经被广泛应用于确认用其它方法发现的苗头化合物。最后，在片段生长的过程中，我们要时刻关注配体效率（ligand efficiency，LE），LE下降得太快不会是一个好的方向。
Dan Erlanson的热门博客名为“Practical Fragments”，【15】涵盖了FBDD的各个方面，是一个非常难得且宝贵的参考资源。
毫无疑问，FBDD将在药物发现方面取得越来越多的成果。
参考文献：
1. Wang, Z.-Z.; Shi, X.-X.; Huang, G.-Y.; Hao, G.-F.; Yang, G.-F. Fragment-based drug design facilitates selective kinase inhibitor discovery. Trends Pharmacol. Sci. 2021, 42, 551–565.
2. (a) Congreve, M.; Carr, R.; Murray, C.; Jhoti, H. A ‘Rule of Three’ for fragment-based lead discovery? Drug Discov. Today 2003, 8, 876–877. (b) Jhoti, H.; Williams, G.; Rees, D. C.; Murray, C. W. The 'rule of three' for fragment-based drug discovery: where are we now? Nat. Rev. Drug Discov. 2013, 12, 644–645.
3. Erlanson, D. A.; Jahnke, W., eds. Fragment-based Drug Discovery. Wiley-VCH: Weinheim, 2016.
4. Tsai, J.; Lee, J. T.; Wang, W.; Zhang, J.; Cho, H.; Mamo, S.; Bremer, R.; Gillette, S.; Kong, J.; Haass, N. K.; et al. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105, 3041–3046.
5. Bollag, G.; Hirth, P.; Tsai, J.; Zhang, J.; Ibrahim, P. N.; Cho, H.;. Spevak, W.; Zhang, C.; Zhang, Y.; Habets, G.; et al. Clinical efficacy of a RAF inhibitor needs broad target blockade in BRAF-mutant melanoma. Nature 2010, 467, 596–599.
6. Bollag, G.; Tsai, J.; Zhang, J.; Zhang, C.; Ibrahim, P.; Nolop, K.; Hirth, P. vemurafenib: the first drug approved for BRAF-mutant cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 2012, 11, 873–886.
7. Zhang, C.; Ibrahim, P. N.; Zhang, J.; Burton, E. A.; Habets, G.; Zhang, Y.; Powell, B.; West, B. L.; Matusow, B.; Tsang, G.; et al. Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2013, 110, 5689–5694.
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12. Vaidergorn, M. M.; da Silva Emery, F.; Ganesan, A. From Hit Seeking to Magic Bullets: The Successful Union of Epigenetic and Fragment Based Drug Discovery (EPIDD + FBDD). J. Med. Chem. 2021, 64, 13980–14010.
13. Lundquist, K. P.; Panchal, V.; Gotfredsen, C. H.; Brenk, R.; Clausen, M. H. Fragment-Based Drug Discovery for RNA Targets. ChemMedChem 2021, 16, 2588–2603.
14. Lu, W.; Kostic, M.; Zhang, T.; Che, J.; Patricelli, M. P.; Jones, L. H.; Chouchani, E. T.; Gray, N. S. Fragment-based covalent ligand discovery. RSC Chem. Biol. 2021, 2, 354–367.
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