PROTAC三元复合物形成构象的计算模拟和判断打分

蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-targeting chimeras, PROTAC）是能够诱导目标蛋白进行泛素化降解的小分子。PROTAC作用时需同时结合目标蛋白和E3连接酶，形成一个三元复合物。进行PROTAC的理性设计需要对它所结合形成的三元复合物的构象有准确的了解，而通过单晶衍射获得准确天然结合构象是个漫长且较昂贵的过程。本研究主要目标就是通过计算模拟甄别出正确性比较大的天然结合构象，研究展示可以通过MD模拟的方式有效鉴别天然和非天然构象。

具体而言，由于天然构象的结合更稳定，在模拟过程中，该构象的稳定存在时间也是相对最长久的，不管是室温下还是升温后。进行一段快速线性升温能够在较短时间内鉴别出天然和非天然构象，并且成功应用在所测试的每一个PROTAC三元体系及其多个候选构象上。该方法之所以有效的重要原因之一，是动态模拟过程内在包含了熵变效果——这是静态能量计算或打分在原理上无法实现的，而与此同时蛋白-蛋白结合时的熵变影响又比蛋白-小分子结合时大很多。该方法有效的另一个重要原因，是打分模拟过程为全水模拟，不像常用的MMGBSA计算需要事后额外选择引入另一套GB参数。该方法文中研究者称之为“升温所加速的构象转移 (Heating Accelerated Pose Departure, HAPOD) ”。

为了展开该研究，首先需要是获得或生成很多个候选构象，并且这些候选构象应该包含正确的（即能量最低的）天然构象。于是，4个已有共晶三元结构（天然构象）的体系被用于测试，从蛋白-蛋白对接和手动加入PROTAC分子为第一步（图1，Stage 0）。对接和手动加入PROTAC是为了获得一个大概合理的结合姿态，离潜在的天然构象还有相当距离，于是用多次较短时间（50 ns）的经典MD弛豫模拟，让三元复合物进入不同的稳定候选构象（图1，Stage 1）。由于候选构象众多，为了进一步筛选，应用常见的MMGBSA方法对所有生成构象进行预打分，但也仅仅是预打分，一个是因为GBSA本身的模型准确性有限，另一个是因为它只有焓变计算。不过好在MMGBSA计算下天然构象排名总体还是靠前的，可以用它作为预筛选（图1，Stage 2）。4个体系的排名前5构象被拿来进行最终的HAPOD打分模拟（图1，Stage 3）。具体的HAPOD过程如图2，进行重复10次的25 ns线性加热（310 K-410 K），然后把三元复合物中的较小蛋白每一帧都重叠于起始结构，再测量相对运动的另一端小分子（图3）。每次25 ns下，与起始结构的RMSD值小于3.5 Å（图2中）的总时间百分比为占用计分（图2右），把每次超过4 Å（包括如果跌回3 Å以内又再次升到4 Å以上）的平均温控温度计为解离计分。两种计分相似度很高，前者略好也为主，后者有助于让研究者大致判断蛋白结合构象是在多高温度产生的转移。4个体系下，前阶段所找到的天然构象在HAPOD计分下都是最优的，正确天然构象被成功甄别（图4）。

图1

图2

图3

图4

一系列候选的三元构象中到底存不存在天然构象？迄今为止的相关报道中尚无该问题的回答，毕竟仅有相对排名无法得知答案。HAPOD看来可以经验性地对此进行判断。为了获得该经验性判断，研究者把所有当下基于VHL和CRBN的三元复合物晶体结构都拿来进行HAPOD计分，以熟悉天然构象所倾向的计分范围，得出经验判断标准，即，如果某构象大于70的占用计分和大于380的解离计分，那么它很可能是天然构象（图5）。

图5

为了进一步扩大HAPOD的应用范围，HAPOD被展示用于甄别其他方法所生成的三元复合物候选构象。上一阶段（图1 Stage 0和Stage 1）涉及手动PROTAC加入和不长但多次经典MD弛豫模拟以获得候选构象的方法，毕竟没有在领域里不断新出现的三元对接方法来得方便、有效、快速。如果HAPOD能直接和其他三元对接串用，那将会是另一大优势。于是，由PRosettaC（J. Chem. Inf. Model. 2020, 60, 4894–4903）三元对接方法快速生成的三元复合物构象也被拿来进行HAPOD评估打分，以确定正确的天然构象。PRosettaC作为当时报道的3篇三元对接之一，效果最好，但所测试的大部分体系里也不能把所生成的天然构象鉴定为排序最高者。本研究直接将3个体系（6BOY、6HAY、6HR2）的多个候选构象（由PRosettaC所生成）拿来进行HAPOD评估打分，效果尚可，但也存在一个潜在的可提高之处。因为PRosettaC所提供的构象是成簇的，HAPOD测试时，近天然构象簇里人为选取了和晶体结构最为接近的构象，毕竟考虑到测试打分的有效性需要越接近天然的构象越稳妥。不过之后在实际使用时，用户是不知道晶体构象的。如果拿近天然构象簇里的随便一个构象进行HAPOD打分模拟，其分数有可能较低，尽管其距离正确晶体的RMSD值并不大。此现象可以理解为，由别的方法或力场形成的构象，在HAPOD所使用的力场下，可能处于较高能区域（图6）。

图6

为了能够让用户在使用时，一个与晶体有一定差异但差异不大的构象也能够获得很高的计分（这也应该是用户的期望），研究者在进行HAPOD之前又先进行了一个4 ns x 5次的快速MD模拟构象优化（类似于Stage 1但简短很多）。这能够让构象在HAPOD力场下往更低的能量地形位置移动，然后从一个很临近但能量更优的位置开始HAPOD模拟。并且，研究者对于PRosettaC的簇问题，采用了先生成平均构象、然后结构能量最小化、再开始使用这个构象的方针。最终，近天然构象得分都是第一或并列第一，晶体构象也全是第一（图7、图8）。

图7

图8

总结而言，（1）HAPOD通过动态模拟的方式比静态计分更优，原因在于动态过程内在包含了熵变效应。（2）整个过程为全水模拟，无需面临介电含蓄水所需额外选择的一套参数。（3）整个研究从理论和实践都相对简化，全采用经典MD，对于MD经验较少的药物化学从业者也可以较快地上手。（4）候选构象的生成可以由较慢的MD模拟（更适用MD熟练者）来做，也可以直接和三元对接（如PRosettaC，或者后面更新发布的PROTAC-Model（J. Med. Chem., 2021, 64, 16271–16281））来一起使用，以最大化生成和正确预测天然构象，进而最终辅助PROTAC的理性设计。这个方法正在被应用于还没有三元复合物单晶衍射的体系中。后续会陆续报道相关PROTAC设计的应用和进一步的实验验证。

J. Med. Chem., 2022, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c02155