黑莫他丁的简洁全合成

多重耐药菌的泛滥严重威胁全球人类的健康，而天然产物是科学家开发新型抗生素对抗此类威胁的主要灵感来源。黑莫他丁（(-)-himastatin）（1）是一种从链霉菌Streptomyces himastatinicus 中分离出来的大环多肽，具有同型二聚体结构，并表现出不错的抗生素和抗肿瘤活性。目前，(-)-himastatin的抗菌机理并不清楚，推测可能与破坏细菌的细胞膜有关。事实上，(-)-himastatin的同源二聚体结构与任何已充分表征的抗生素类别都不相似，包括已知的那些能破坏细菌细胞膜的环肽。(-)-himastatin最显著的结构特征是环色氨酸残基之间的中心C5-C5'键，该键在生源合成的最后一步构建，对已观察到的抗革兰氏阳性菌活性至关重要。其它结构特征包括 D-和 L-氨基酸的交替序列、缩肽键和具有 γ-羟基化的哌酸残基。此外，在(-)-himastatin之后发现的相关单体天然产物，包括(-)-NW-G01 (S2)，均在化学酶二聚化后显示出强抗生素活性。Danishefsky课题组早前应用Stille 偶联反应来构建C5-C5' 键，而后双向构建二聚体环色氨酸，这对(-)-himastatin 全合成以及环色氨酸残基的Cα立体化学的研究具有里程碑意义。

图1. himastatin的生源合成和本文的仿生合成策略。图片来源：Science

近日，美国麻省理工学院（MIT）的Bradley L. Pentelute和 Mohammad Movassaghi等研究者受到生源合成路线的启发，从简单易得的前体5出发，通过多肽偶联得到(+)-himastatin单体（2），再经仿生的单电子氧化、自由基偶联便可实现二聚化，从而成功地实现(-)-himastatin（1）的全合成。另外，作者还将这种方法与模块化合成相结合，简洁高效地获得了十多种黑莫他丁衍生物，这为进一步详细研究和评估 (-)-himastatin的生物活性以及后续合理设计和合成活性更佳的(-)-himastatin类似物打下了坚持基础。相关成果发表于Science 上。

图2. 环色氨酸、环色胺和吲哚的氧化二聚。图片来源：Science

首先，作者筛选了二聚化过程的单电子氧化剂，发现过量的六氟锑酸银(I)与1,2-二氯乙烷中的非亲核嘧啶碱TTBP结合后，成功地催化了环色氨酸、环色胺和吲哚啉衍生物的二聚反应并构建其C5-C5' 键（图2A）。最值得注意的是，硫代硫酸钠水溶液还原法对二聚体的最佳分离至关重要，均可分离出单一的同源异构体。有趣的是，exo-构型的二酮哌嗪6e和6g进行氧化反应时，在相应的endo-构型衍生物6f和6h的一半时间内就可被完全氧化，这可能是与底物6e和6g中N1位点的可接近性增加有关。吲哚啉6k中甲基取代N1不会抑制二聚化，这与自由基中间体相一致，而非闭壳层芳基阳离子。

其次，为了研究C-C键形成二聚反应的机理，作者设计了一系列含有二氢吲哚结构的实验（图2B）。当C2-甲基6i和C2-苯基吲哚6j等摩尔混合后在最优条件下进行反应时，可以类似的单电子氧化速率产生同源或者异源二聚体的混合物，而二氢吲哚 6j和6k 的等摩尔混合物进行氧化二聚化反应时则主要形成同源二聚体以及微量的异源二聚体 7n。若限制氧化剂的用量，6k要比6j更易实现选择性的二聚化。这些结果说明C5-C5'键的形成优先通过自由基-自由基偶联而非亲核捕获机制，此结论与环色氨酸 6a 的二聚化过程中无其他产物情况相一致。

图3. (-)-himastatin (1) 的全合成。图片来源：Science

随后，作者以混合溶液-固相合成策略，并以最小化纯化和分离步骤，快速且可定制地合成(+)-himastatin单体（2）（图3）。即树脂结合的D-苏氨酸（9）、L-亮氨酸（(-)-10）和三缩肽片段（(+)-8）三者依次偶联完成五肽酸砌块（(+)-11）的合成，再与环色氨酸（(-)-12）进行偶联，以 64% 的总产率获得线性六缩肽（(-)-13）。接着，(-)-13经末端脱保护后以49%的总产率环化构建(+)-himastatin 单体（2），其1H和13C核磁数据以及旋光度均与文献一致。需要指出的是，作者开发的高效混合合成策略仅需一次色谱纯化便可完成中间体六缩肽（(-)-13）的可聚合组装，同时该模块化策略还可避免溶液合成面临的分离纯化以及后期氧化引起的立体选择性问题。接下来，作者将重点放在生物合成启发的氧化二聚化方法来实现(-)-himastatin的全合成（图3）。尽管六氟锑酸银(I)和三氟甲磺酸铜(II)对简单的环色氨酸的二聚化有效（图2A），但对复杂结构(+)-himastatin单体（2）中的环色氨酸反应性并不好，这可能是由于不溶性氧化剂的聚集和失活以及复杂大环肽底物的反应活性较低。为此，作者对氧化剂进行了筛选，发现不溶性氧化剂确实对反应无效，而可溶性氧化剂则能实现氧化，但肽对C-Br键的亲核取代（SNAr）占主导地位。最终，作者确定了六氟锑酸铜(II)可催化(+)-himastatin单体（2）的二聚化，以40%的产率完成了(-)-himastatin的全合成。总之，作者利用易得前体，经5步固相反应和6步液相反应，以11步、13%的总产率实现了天然产物(-)-himastatin的全合成，所有的光谱数据和旋光度均与文献一致。

图4. himastatin衍生物的设计与合成。图片来源：Science

为了展现该合成策略的通用性，作者还合成了(-)-himastatin（1）的对映异构体（ent-(+)-1）和内消旋衍生物meso-1。这些立体化学探针是由具有相反手性的前体制备，而异源二聚体内消旋himastatin则是通过单体2对映体的等量混合物二聚并分离所得。在所有情况下，模块化杂合肽合成法均可引入取代的残基，并且在合成(-)-himastatin开发的条件下所有的单体均可二聚化，从而以21-38%的产率得到相应的衍生物(-)-15、(-)-17、(-)-19、(-)-21、(-)-23（图4A）。此外，作者还设计了一种荧光异二聚体探针，并预测其可保留抗生素活性。Himastatin单体（(+)-2）和叠氮赖氨酸单体（(+)-22）结合，然后经还原-酰化序列进行标记便可快速制备TAMRA-himastatin 异源二聚体(-)-25（图4B）。值得一提的是，该方法对 TAMRA-himastatin 同源二聚体 (-)-S17 的合成同样适用。

图5. 对革兰氏阳性菌的抗生素活性评估。图片来源：Science

接下来，作者测试了合成天然产物(-)-himastatin及其衍生物的体外抗菌活性。如图5所示，(-)-himastatin（1）及其对映异构体和消旋体对常见的革兰氏阳性菌均显示出抗生素活性，而himastatin的立体化学对其抗菌活性的影响却可以忽略不计。有趣的是，各二聚体的单体化合物都比相应二聚体的抗菌活性差，进一步证明了这类化合物的二聚化结构特征对抗生素活性的关键作用。此外，(-)-himastatin（1）的衍生物中，(-)-15、(-)-21、(-)-23对常见的革兰氏阳性菌都具有强抑制活性，而(-)-17、(-)-19的抗菌活性则较差。需要指出的是，含荧光基团的TAMRA-himastatin异源二聚体(-)-25对Bacillus subtilis 具有较好的抑制活性，但其同源二聚体(-)-S17和其它荧光团取代的同源二聚体himastatin类似物则无抑制活性。

鉴于(-)-himastatin (1) 中包含特有的结构（如：缩肽键、5-羟基哌酸残基），因此作者评估了含有特定结构的衍生物的抗生素活性。结果表明，当酯键被仲酰胺（(-)-15）或叔酰胺（(-)-17）取代时，抗生素活性存在降低的趋势。另外，若用脯氨酸残基替换5-羟基哌酸残基时，抗生素活性完全消失。进一步研究发现氢键和构象限制的结构刚性对 himastatin 的抗菌模式产生了重要的影响。最后，作者将化合物与共聚焦显微镜观察抗生素对枯草芽孢杆菌的生物效应实验方法相结合，进一步研究了(-)-himastatin (1) 的抗生素活性，即以异源二聚体探针TAMRA-himastatin (-)-25直接观察其与细菌的相互作用并监测细胞定位，并发现药物分子聚集在细菌的细胞膜附近，验证了此前推测的(-)-himastatin (1) 的抗生素活性作用靶点在细菌细胞膜。

总结

本文研究团队在生源合成的启发下，采用先合成单体最后再二聚化的策略，从简单易得的前体出发实现了(-)-himastatin的简洁高效全合成，并获得多种衍生物及荧光探针。该团队对(-)-himastatin及其衍生物的抗菌活性进行了深入的研究，并初步揭示(-)-himastatin杀菌的机制与破坏细菌细胞膜相关。这种具有独特同源二聚体结构的抗菌化合物，有望在未来帮助我们更好地应对耐药菌的威胁。

Science, 2022, 375, 894-899, DOI: 10.1126/science.abm6509