可再生的木质纤维素，可用于生产清洁和可再生能源、材料和精细化学品，并可作为化石资源的替代品。充分利用这些可再生资源对于实现联合国可持续发展目标7和12（即确保人人获得可负担、可靠和可持续的现代能源；确保可持续消费和生产模式）至关重要。然而，木质素碳水化合物复合物（Lignin Carbohydrate Complex, LCC）所引起的木质纤维素的顽固性，极大地限制了其在工业上的应用。因此，木质素和碳水化合物的高效分离具有广阔的应用前景。
葡萄糖醛酸酯酶（Glucuronoyl esterases, GEs），是一种可以从LCC中的多糖中解耦木质素的酶，从而提供了一种经济有效的方法来克服木质纤维素顽固性这一障碍。然而，GEs是相对较新的用于生物质转化相关的酶，因此这类酶的最佳使用尚未实现。例如，GEs水解LCC的限速步骤尚未确定，显著地限制了该类酶的工程改造，妨碍了木质纤维素生物乙醇和生物材料成本的进一步降低。
这篇工作所研究的GE具有丝氨酸水解酶家族标志性的两个催化残基，即丝氨酸（S267）和组氨酸（H408）。但却具有两个独有的特征：i）两个酸性残基（E290和D356）,而典型的丝氨酸水解酶只有一个；ii）精氨酸（R268）作为氧阴离子穴稳定四面中间体结构，而典型的丝氨酸水解酶的氧阴离子穴是由催化区周围的几个残基骨架构成。如图1所示，作者借鉴丝氨酸水解酶推导出了GE的催化循环步骤。
图1. GE的催化机制及其参与催化的残基。
接下来作者通过QM/MM计算，自由能计算、酶促动力学实验和蛋白结晶学实验，对GE的水解循环进行了详细的机理研究。由于本文研究的GE的独特性，作者首先用S267-H408-E290（SHE unit），即丝氨酸典型的催化三单元模式进行研究。如图2、3和4所示，作者揭示了GE催化模型底物的酰化、中间过程和去酰化的详细机制，并发现去酰化是GE催化模型底物的限速步骤。同时，第一步质子转移过程，即S267-H到Nε-H408（酰化中）和H2O-H到Nε-H408（去酰化中）是酰化和去酰化反应中的限速环节。
图2. SHE催化三单元的酰化反应。
图3. SHE催化三单元去酰化反应前的中间过程。
图4. SHE催化三单元的去酰化反应。
由于本文研究的GE的独特性质，作者进一步选取了S267-H408-D356（SHD unit）和S267-H408-E290-D356（SHED unit）分别对GE催化模型底物的酰化和去酰化过程进行了计算。如图5所示，相比SHE和SHD催化单元，SHED作为催化单元的自由能垒更低。
图5. SHD和SHED催化单元酰化和去酰化中的质子转移过程。
接下来作者用阿伦尼乌斯分析法测定实验上的Ea值。如图6所示，实验值与SHED催化单元计算所得能垒最为接近。另外，作者还量化了GE独特的两个酸性残基的在自由能上的贡献，详见Supporting信息。
图6. GE催化反应的Arrhenius活化能测定。
下面作者继续研究了GE另一个独特的参与催化的残基（R268）作为氧阴离子穴的作用。如图7（a-c）所示，R268在TI1和TI2中形成了多条氢键以稳定四面中间体结构。作者在计算中将R268突变为丙氨酸并进行QM/MM计算后发现，R268A使得酰化能垒高出3 kcal/mol左右，而去酰化过程由于超高的自由能垒已经不能发生。若去酰化不能发生，那GE将与模型底物一直保持共价中间体的复合结构状态。
图7. R268在催化中的作用。
为了进一步探索精氨酸的作用，作者在实验中将R268突变为丙氨酸并进行了蛋白-底物共结晶实验。如图7e所示，作者在实验中获得了GE与模型底物的共价中间体的晶体结构，符合计算所做的预测。经过蛋白三维结构比对后可见，计算获得的共价中间体结构与实验中获得的蛋白结晶结构完全一致。此外，作者还进行了酶促动力学实验，实验结果表明R268A使得酶促效率显著下降，详见原文表2。
最后，作者探索了GE降解天然底物时可能的限速步骤。作者首先构建了由纤维素链和木聚糖链组成的复合底物模型，并计算了GE从该复合底物和模型底物上解离的自由能（如图8）。结果表面，GE从复合底物上解离的能垒显著高于模型底物，同时作者推测解离可能是GE降解天然底物时的限速步骤。
图8. GE从模型底物和复合底物上解离的过程。
小结
本文所研究的GE是一种丝氨酸水解酶，该家族包括许多重要的工业酶和代谢酶，因此相关催化机制的研究具有重要意义。此外，GE具有一个独特的催化机制，类似于典型的三联体催化单元，但其有一对酸性催化残基，以及精氨酸作为氧阴离子穴。因此，本文中对GE的催化机制及限速环节的详细解析不仅将有助于实现更具成本效益的木质纤维素生物转化过程中相关酶的工程化改造，也将有助于受这一经典催化系统启发的人工模拟酶的构建。
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