方酸，又称二次酸，化学名为3,4-二羟基环丁-3-烯-1,2-二酮，是一种平面芳香性结构，因其独特而近乎完美的方形结构而得名，是有机化学中的多功能合成子。在药物化学领域，方酸由于具有相对的高反应活性可能引起体内毒性的风险，直到近几年，越来越多的研究表明方酸及其类似物具有多种独特的理化性质和药代动力学性质，才开始受到药物化学家的关注。
图：方酸酸性及其共振结构
方酸是一种对称的平面性双质子四元碳氧化合物，具有独特的2π拟芳香性。由于具有共振稳定的芳香性方形二价阴离子结构，方酸具有很高的双重酸性(pKa1=0.54,pKa2=3.58)。方酰胺是应用最为广泛的方酸衍生物，其分子结构可通过特异性的分子识别与生物靶标形成多种相互作用，二级方酰胺可同时作为氢键供体和受体或氢键供-受体，因此可与生物靶标形成四个氢键相互作用，二级方酰胺形成氢键的能力也是其高熔点(275-300℃)、低水溶性的原因之一。
图：二级方酰胺形成氢键能力
在基于方酰胺人工受体识别阳离子的研究中，受体具有很好的氢键接受能力以识别阳离子(铵离子)，并且接受能力随着复合物芳香性增加而增强；同样，当方酰胺作为氢键供体识别阴离子(羧酸)时，其氢键供体能力同样随着复合物芳香性的增加而增加；当同时结合阳离子和阴离子时，复合物芳香性最高，芳香性：复合物3>2和1。
图：方酰胺和脲形成氢键的能力比较
此外，静电势能研究表明，相比于仅有单羰基的脲基片段，两个羰基的协同作用使方酰胺能与受体产生更广泛而有效的相互作用。方酰胺和酰胺具有一定的相似性，但包含两个羰基和NH的方酰胺具有刚性平面结构因而具有独特的性质，其中sp2杂化的氮原子提供孤对电子与π电子系统形成共轭使得这种结构异常稳定，NH和羰基的相互影响导致方酰胺可形成两性离子结构，两性方酰胺形成的偶极子能够模拟α-铵离子羧酸片段作为α-氨基酸的生物电子等排体。
图：方酰胺的结构稳定性及其两性结构
方酸类似物是药物化学中的优势骨架结构，在药物设计中具有重要应用。首先，方酸类似物通常没有高脂溶性和低水溶性的问题，尤其是方酸或方酰胺骨架与胺或羧酸组合时，得到的化合物溶解性普遍增加，进而可作为合适的治疗制剂。其次，方酸类似物可作为药物设计中羧酸和氨基酸等的非经典电子等排体。
通常，方酸衍生物的核心结构在体内水性环境下是化学稳定的。因此基于方酸骨架的化合物具有开发成为药物的潜力，同时也报道了许多活性分子。
N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)是离子型谷氨酸受体的一个亚型，其分子结构复杂，药理学性质独特，在神经系统发育和神经元回路的形成中发挥着重要作用。Perzinfotel是一种有效的NMDA 受体选择性拮抗剂，具有神经保护作用，对谷氨酸位点具有较高亲和力(IC50=30nM)，为了改善生物利用度，研究人员设计得到了其前药Perzinfotel prodrug，半衰期和活性得到明显提高。默沙东开发的Navarixin是一种趋化因子受体2(CXCR2)拮抗剂，目前处于实体瘤联合治疗的二期临床。
图：方酸类似物活性分子
方酸二正丁酯SQX770是一种治疗口唇疱疹的药物，目前处于处于二期临床。正大制药开发的Pibutidine是一种组胺H2受体拮抗剂，曾处于治疗胃肠道溃疡的一期临床试验，但由于心脏毒性和胃肠毒性于2000年被迫终止。百时美施贵宝开发的组胺H2受体拮抗剂BMY-25368曾进入十二指肠和胃溃疡治疗的三期临床，但也终止了。化合物4具有明显的抗结核活性，但代谢清除率高，当联用CYP抑制剂时能够明显提高其血浆浓度。通常一些方酸衍生物对酶是稳定的，但有些衍生物也可被不同的酶代谢，因此，可进一步探究其代谢机制。
图：方酸及其衍生物的生物活性
单方酰胺(Squaramates)常用于与赖氨酸和其他胺的生物偶联；二方酰胺(Squaramides)则可作为核苷酸或寡核苷酸中磷酸基团的替代物。在化学生物学中，方酸类似物能与蛋白质或碳水化合物偶联，也可作为离子受体。在药物化学中，方酸类似物具有抗疟原虫、抗癌、抗菌，抗病毒等多种生物活性，是开发理想药物的重要优势骨架。原虫是一种单细胞真核生物，能引起疟疾、人类非洲锥虫病、利什曼病、美洲锥虫病等疾病。许多抗寄生虫药物由于耐药性限制了其广泛应用，开发新型作用机制的抗原虫药物具有必要性，方酸衍生物是其中一类有前景的化合物。
基于方酰胺和氯喹设计的化合物5对氯喹耐药的疟原虫具有明显的抑制活性，其活性是母体药物氯喹的2倍左右，且在NIH 3T3和HEK293T细胞中没有毒性。基于氨基喹啉和方酰胺设计的化合物6在肝期疟原虫感染的人肝细胞Huh7中，其抗疟活性是标准药物伯氨喹的7.3倍，是一类新型抗疟疾化合物。
图：具有抗原虫活性的方酸衍生物
利什曼病是一种全世界流行的寄生虫病，方酰胺化合物7具有抗利什曼原虫活性，活性高于标准药物Glucantime且毒性更低，对原虫Leishmania infantum的抑制IC50为16.3 μM。美洲锥虫病是一种由锥虫Trypanosomacruzi引起的昆虫传播性疾病，方酸衍生物也具有显著的抗美洲锥虫活性，方酰胺化合物8具有抗美洲锥虫活性，体内外实验证明对急性和慢性美洲锥虫病具有很好的效果，对锥虫Trypanosoma cruzi的抑制IC50为9.4 μM。另一个方酰胺化合物9在体内外均具有抗美洲锥虫活性，活性高于标准药物苯硝唑，且毒性更低。机制研究表明9能够使线粒体膜去极化，导致能量不足，进而诱导细胞死亡。细菌感染是最大的健康问题之一，越来越多的抗生素耐药问题，迫切需要新型的抗菌活性化合物。化合物10具有中等到较弱的抗幽门螺旋杆菌活性，这一发现后来推动了有效的组胺H2受体拮抗剂Pibutidine的发现。细菌可利用菌毛与宿主细胞连接，I型菌毛介导的甘露糖特异性细菌粘附通常通过凝集素FimH实现。方酸单酰胺甘露糖苷化合物11和12可抑制I型菌毛介导的甘露糖特异性细菌粘附过程，其中11对FimH具有较高的亲和力，且活性比标准化合物pNPMan高出50倍左右。
图：具有抗菌活性的方酸衍生物
RNA聚合酶对基因表达、细胞生长和存活至关重要，是重要的抗菌靶点。基于高通量筛选并优化获得的化合物13具有很好的抗菌活性，可结合RNA聚合酶开关区域，导致该区域功能失活进而抑制后续转录。构效关系研究表明，末端异恶唑和苯环是关键基团，可结合开关区域的特异性口袋。ATP合酶是细菌能量代谢过程的关键酶，是有前景的抗菌靶点。化合物4是选择性的结核分枝杆菌ATP合酶抑制剂，具有抗结核分枝杆菌活性，且毒性低，具有贝达喹啉(已上市的ATP合酶抑制剂用于肺结核治疗)结构，在贝达喹啉耐药突变的结核分枝杆菌中没有出现交叉耐药。癌症治疗一直是研究热点，对癌细胞产生毒性，同时减少对正常细胞损害是抗癌药物治疗的研究重点。Pt复合物14在T24细胞中具有明显细胞毒作用，是首个报道具有癌细胞毒性的方酸衍生物，活性不及顺铂，但具有进一步研究的价值。大环方酰胺化合物15具有抗癌活性，其中环的大小对抗癌活性至关重要，具有5个方酰胺骨架的15具有合适的连接子、合适的构象和柔性，这对于靶标结合能力至关重要。在Jeko-1和Z-138细胞中，具有很好的抗增殖活性，而对正常细胞没有明显影响，非环状寡聚方酰胺和更小(2-4)环方酰胺则没有活性。基于微管蛋白抑制剂combretastatinA4(CA4)构效关系的研究，研究人员引入方酸片段作为顺式构象限制骨架设计了CA4模拟物16和17，两者在白血病细胞CEM中与CA4(IC50=1.6 nM)具有相似的活性。
图：具有细胞毒作用的方酸衍生物
化合物18在多种癌细胞中具有抗增殖活性，在HGC-27细胞中IC50为1.81μM ，在Hela细胞为34.63 μM，其中NH对活性至关重要。
真核翻译起始因子4E(eIF4E)能刺激与癌细胞生长和转移有关的蛋白质翻译，是重要的抗癌靶点，作为真核翻译起始因子4F复合物的重要组成部分，4F复合物能够识别mRNA 5’端的7-甲基鸟苷帽结构，化合物19和20具有中等的eIF4E帽结合抑制活性。
图：具有细胞毒作用的方酸衍生物
化合物21在Hela细胞中具有明显细胞毒性，IC50为0.88 μM，进一步以荧光基团修饰环丁烯酮骨架获得的22可在细胞核中积累，可用于细胞成像。方酸衍生物的抗病毒活性报道相对较少。Tat蛋白是HIV-1复制和转录必须的特异性反式作用因子，是理想的抗HIV-1感染靶标，与其顺式作用应答元件TAR RAN结合是发挥功能，参与RNA聚合酶介导的病毒转录必修的。研究人员以方酰胺作为胍基的电子等排体设计的拟肽化合物23能够结合TAR RNA(KD=7.7 μM)，抑制Tat-TAR相互作用，具有抗HIV活性。
图：具有抗病毒活性的方酸衍生物
化合物是24是另一个具有抗HIV活性的方酰胺衍生物，能抑制HIV-1蛋白酶抑制活性，其对HIV-1蛋白酶的抑制常数Ki=0.51 nM。
趋化因子受体CXCR1和CXCR2属于G蛋白偶联受体(GPCR)超家族成员, 是介导相应趋化因子发挥生物学功能的关键受体，可受到生长相关蛋白α(CXCL1)和白介素8(CXCL8)的激活，选择性的CXCR2拮抗剂是炎症相关疾病治疗的靶点。
图：方酸衍生物类CXCR2拮抗剂
Navarixin是一种有效的CXCR2拮抗剂，对CXCR2具有很好的亲和力，解离常数Kd为0.049 nM，而对CXCR1的Kd为3.9 nM，目前处于实体瘤治疗的二期临床。研究人员基于之前的研究，以方酰胺片段作为脲基和N-氰基胍基的电子等排体设计得到化合物25具有很好的CXCR2抑制活性和中等PK性质，构效关系研究表明，方酰胺NH和酚羟基对活性至关重要，磺酰胺基则用以调控分子理化性质且对酚羟基没有明显影响。利用同样的策略，另外的研究人员发展了系列具有CXCR2抑制活性的化合物(26-31)，进一步证明二芳基方酰胺类化合物的苯酚结构在方酰胺左侧是优势骨架。
图：方酸衍生物类CXCR2拮抗剂
基于二芳基方酰胺化合物的构效关系设计获得了高亲和力的CXCR2拮抗剂32，IC50为36 nM，为了避免硝基代谢带来的副作用，引入酰胺基替换硝基获得化合物33，其体外活性增强，溶解性也增加。进一步优化获得化合物34，亲和力提高，口服生物利用度很高，当以杂环取代右侧的苯环时获得了最有效的化合物Navarixin。
图：方酸衍生物类CXCR2拮抗剂
方酰胺胆碱盐化合物35是诺华开发的CXCR2选择性拮抗剂，可能成为第一个治疗慢性阻塞性肺病(COPD)的药物，其中不对称方酰胺胆碱盐可能有效提高CXCR2拮抗剂的药物质量。CGS-19755是一种有效的NMDA受体拮抗剂，构效关系研究表明分子中磷酸是关键药效团，以方酰胺片段替换α-氨基酸片段设计得到化合物36，在几种神经退行性疾病模型中具有良好的临床前数据。
图：方酸衍生物类NMDA受体拮抗剂
蛋白酶激活受体(proteaseactivated receptors, PARS)属于G蛋白偶联受体家族成员，可通过介导细胞外信号调节激酶(extracellar signal-regulated kiase, ERK1/2)信号转道通路，引起细胞核反应，激活多种细胞转录因子，人PAR1参与凝血酶诱导的血小板聚集，PAR1拮抗剂可作为抗血小板活性分子。肉桂香哌嗪F16357是一种PAR1抑制剂，以方酸片段作为羰基电子等排获得的37是有效的PAR1拮抗剂，10 μM浓度下具有97%的拮抗活性。
图：方酸衍生物类PAR1抑制剂
玻连蛋白是一种整合素，属于血小板糖蛋白组成员，是一种介导细胞和其外环境之间的连接的跨膜受体，化合物38是一种玻连蛋白受体(αvβ3)拮抗剂，可用于球囊血管成形术后再狭窄的治疗。G蛋白偶联受体55(GPR55)定位于脊髓感觉轴突，在神经病理性疼痛、癌症和炎症中起关键作用，化合物39表现出与内源性配体类似的行为，可调控GPR55活性并抑制背根神经节(DRG)伤害性轴突。
图：化合物38-41结构
基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase)属于内肽酶家族成员，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。基质金属蛋白酶-1(MMP-1)几乎能降解细胞外基质的所有成分，参与机体的大部分生理病理过程，其过表达与多发性硬化、类风湿性关节炎、血管生成和转移，是相关疾病治疗的靶点。基于方酸结构的肽类化合物40是一种MMP-1抑制剂，IC50为15 μM。化合物41是一种HDAC抑制剂，构效关系研究表明，4-三氟甲基苯基能够提高活性和改善代谢清除率，而苄基取代则活性降低，具有小取代的脂肪侧链能够改善分子溶解性。乙酰胆碱酯酶(AChE)是阿尔兹海默症(AD)治疗的重要靶点，他克林(Tacrine)是第一个临床治疗AD的AChE抑制剂。方酰胺结合他克林设计的化合物42和43具有AChE抑制活性，且在HepG2细胞中毒性很低。N-羟基方酰胺衍生物44是一种锌金属酶ADAMTS-5(骨关节炎治疗靶点)抑制剂，IC50为2.6 μM。
图：化合物42-44的结构
Plk1(Polo-like Kinase 1)属于Polo样激酶家族成员，是一类广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶，Plk1参与细胞分裂，DNA损伤修复途径，细胞凋亡和细胞周期进程中关键步骤的调节，是重要的癌症治疗靶点。基于HTS筛选获得的化合物45具有很好的Plk1抑制活性，进一步的构效关系优化获得化合物46的活性和PK性质得到明显提升。
图：方酸衍生物类Plk1抑制剂
生物电子等排体替换是药物化学中的经典设计策略，对于分子的设计具有重要意义。方酸片段可作为羧酸、四氮唑、磷酸的生物电子等排体，例如血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂中的羧酸和四氮唑的电子等排体替换，核苷酸中磷酸基团的电子等排体替换。
图：方酸及其衍生物片段作为生物电子等排体
氨基方酰胺片段可作为非手性α氨基酸片段和胍基的电子等排体，例如NMDA受体拟肽拮抗剂设计中用于替换谷氨酸、精氨酸片段。二级方酰胺可作为脲片段和N-氰基胍片段的电子等排体，例如CXCR2拮抗剂的设计中的应用。随着研究的不断深入，方酸衍生物片段可以作为更多优势骨架的非经典生物电子等排体用于药物设计。方酸衍生物方酰胺、单方酰胺、方酸酯等是结构简单而有用的分子，虽然其结构很早被发现，但作为潜在的治疗药物研究刚刚开始，原因在于方酸衍生物分子包含高活性基团往往和毒性、非选择性等副作用相关。随着方酸及其衍生物研究的深入，药物化学家发现这类结构具有多种生物活性和特征，可能在发现新型分子以解决耐药问题方面实现突破，因此开始受到药物化学家的关注，相信在未来方酸及其衍生物会给药物设计领域带来更多的惊喜。
1.R. Ian Storer, Caroline Aciro, et al.Squaramides: physical properties, synthesis andapplications. Chem. Soc. Rev.2011, 40, 2330-2346.2. Jan Chasák, VeronikaŠlachtová, et al.Squaric acid analogues in medicinal chemistry. Eur. J. Med. Chem.2021, 209,112872.标签： 药物设计
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