利用PROTACs原理设计开发出可高效降解FLT3-ITD蛋白降解剂

急性髓系白血病 (Acute myeloid leukemia, AML) 是一种具有遗传多样性和侵袭性的血液恶性肿瘤，源于未成熟髓系祖细胞分化受阻和无序增殖。Fms相关酪氨酸激酶3（FLT3）是一种在造血细胞上表达的酪氨酸激酶受体。在约30%的急性髓系白血病（AML）病例中发现FLT3的激活突变。

FLT3有两种主要的激活突变：酪氨酸激酶近膜结构域的内部串联复制 (ITD) 和酪氨酸激酶结构域的点突变（通常在D835残基）。FLT3-ITD是FLT3突变最常见的一种形式，在AML患者中发生率为15%-35%。该突变导致FLT3构成性激活，从而激活多种细胞内信号分子，如PI3K/AKT、MAPK/ERK，进而促进白血病细胞增殖，抑制细胞凋亡。多项研究表明FLT3-ITD患者复发率高，临床预后差，总生存率低。因此，FLT3-ITD是治疗FLT3-ITD阳性AML的有效靶点。

在过去的十年中，许多药物被开发为有效的FLT3-ITD抑制剂，例如一代的Dovitinib、Sorafenib、Midostuin等，最近，一些相对更具选择性的第二代FLT3-ITD抑制剂，例如Crenolanib、Quizartinib、FF-10101等高选择性的FLT3-ITD分子也在经历不同阶段的临床试验中。然而，大多数患者最初得到缓解，很快出现耐药性和其他的安全问题。为了满足日益增长的AML病人的临床需求，研发更加安全高效的药物分子依然迫在眉睫。除了直接抑制FLT3的激酶活性外，诱导FLT3- ITD降解正成为一种新策略。蛋白质水解靶向嵌合体 (PROTACs) 技术提供了一个理想的方法。

图1. PROTACs设计原理。

南开大学药学院杨诚/杨光团队致力于药物化学和化学生物学的研究。第一代FLT3-ITD抑制剂——多韦替尼（Dovitinib）具有优异的体内外活性。但是它是一个多靶点的激酶抑制剂，FLT3-ITD选择性差，临床使用时具有明显的偏靶效应，药物的使用量大，药物的体内蓄积等副作用也比较明显，临床治疗效率较低。本项目组针对这一缺点，在此基础上通过PROTAC分子的设计原理，优化E3连接酶配体和linker的结构，筛选得到两种化合物（1和2）具有显著的抗MOLM-13和MV-4-11细胞（FLT3-ITD+ AML细胞）增殖作用。

图2. 基于Dovitinib结构的PROTAC分子设计与筛选。

进一步的生物学评价表明，用药物处理以后，细胞内形成蛋白、PROTAC分子和E3连接酶三元复合体，显著上调FLT3-ITD蛋白的泛素化水平并诱导FLT3-ITD蛋白以泛素-蛋白酶体依赖的方式发生高效的降解，并在低纳摩尔浓度下即可完全阻断其下游信号通路。

图3. 化合物1和2降解FLT3- ITD，并以时间依赖性的方式抑制FLT3下游信号传导。

图4. 化合物1和2通过泛素-蛋白酶体系统诱导FLT3-ITD蛋白降解。

为评价化合物1和化合物2的体内抗AML效果，该项目采用了新颖的MV-4-11小鼠尾静脉荷瘤评价模型，通过尾静脉注射MV-4-11细胞到全免疫缺陷的小鼠，然后静脉注射给药化合物1和2（3 mg/Kg），最后利用CD45抗体标记骨髓中的AML细胞比例来评价该药物对AML的治疗效果。结果显示，PROTAC分子1和2可以显著抑制荷瘤动物体内MV-4-11细胞的增殖。

图5. 化合物1和2在体内模型中的抗白血病作用。

本项目还选择了化合物2和Dovitinib对40种常见的激酶进行抑制活性的测试。作者发现，化合物2对FLT3-ITD激酶抑制的选择性显著优于Dovitinib。这很可能是由于PROTACs化学修饰Dovitinib的结构恰好抑制其与多种激酶蛋白的结合，反而增加了化合物结合FLT3-ITD蛋白的选择性。从而也为多激酶靶点的PROTACs分子的设计与结构改造提供了新的思路。

表1. Dovitinib和化合物2的选择性激酶活性测定。

综上，该团队的研究表明，无论是在体内还是体外，经PROTAC原理，化学修饰的Dovitinib类似物，可以提供比Dovitinib更高效的对FLT3-ITD+ AML细胞的杀伤能力。筛选得到的PROTACs在低纳摩尔浓度下完全降解FLT3-ITD蛋白，并阻断其下游信号通路。为FLT3-ITD+的AML的药物开发提供了新思路。

该成果于近日发表于药物化学领域顶级期刊Journal of Medicinal Chemistry 上，本文还被评为药物化学杂志的封面文章。东莞理工学院的王晓季教授，南开大学药学院杨诚教授、杨光副研究员为该论文共同通讯作者。南开大学药学院博士生曹胜、硕士生马岚、博士生刘煜琳和博士后魏明明博士为该论文共同第一作者。该项工作得到了国家自然科学基金，天津市科技重点支撑项目等基金的支持。

J. Med. Chem., 2021, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00996