碘加速鹅膏蕈碱类毒素的合成

开发多肽类药物一直是药物研发的热点且极具挑战，多肽环化策略的发展加速了生物活性分子的发现和研究，尤其是其在蛋白-蛋白相互作用（PPI）领域的应用。在自然中，环化的非核糖体多肽（Nonribosomal peptides）具有多样性的生物活性，例如环孢菌素（Cyclosporine，免疫抑制剂）和万古霉素（Vancomycin，抗生素）。作为核糖体多肽类天然产物（RiPPs）、鹅膏蕈碱（amanitin）和鬼笔环肽（phalloidin）分别对真核细胞的RNA聚合酶和F-肌动蛋白表现出极强的抑制作用，所以具有广泛的生物学以及药理学的用途。最近，德国Heidelberg Pharma基于鹅膏蕈碱研发的抗体偶联药物HDP-101（图1）被FDA批准进入临床试验，用于治疗多发性骨髓瘤。作为首个RNA聚合酶抑制剂类的抗体偶联药物，鹅膏蕈碱的化学合成以及构效关系的研究亟待发展。

图1. 抗体偶联药物HDP-101结构示意图

alpha鹅膏蕈碱是从毒蘑菇死亡帽中分离出来的双环八肽，其对大鼠的口服半数致死剂量（LD₅₀）为50-100 µg/Kg。从结构来看，合成该类分子的主要挑战是如何构建6-OH-Trp 和Cys之间的tryptathionine桥键。2018年Perrin课题组利用分子内Savige-Fontana反应完成了该分子的首次全合成（图2a，J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 6513–6517），合成步骤繁琐且最终产物只有微克级别。随后Heidelberg Pharma利用光氧化策略优化了该反应（图2b，Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59, 11390 –1139），实现了alpha 和beta 鹅膏蕈碱的合成。近期，柏林工业大学Roderich D. Süssmuth教授课题组开发了 [5+2+1] 碎片缩合的方法，在液相中完成了该分子的合成（图2c，Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59, 5500 –5504），这为大规模制备打下了基础。但是迄今为止，所有的合成方法都需要预先制备正交保护的合成模块或者中间体，往往效率不高。

图2. tryptathionine桥键合成。图片来源：JACS

2019年Süssmuth教授课题组将碘介导的tryptathionine合成策略成功应用在鬼笔环肽分子的全合成（Chem. Eur. J., 2019, 25, 8030–8034），但意外的是还没有应用到鹅膏蕈碱类分子上。基于以上背景，Roderich D. Süssmuth课题组首先利用分子动力学模拟（MD simulation）和核磁共振溶液结构计算，阐明碘介导的方法不适用于大环内酰胺4（图3b-3d）。随后作者调整合成策略，以线性肽（2 和6）为模型分子，碘介导的环化结果表明，该方法对包含“Gly-Ile-Gly”片段的线性肽6具有较强的选择性（图3g）。为了考察该反应的通用性，作者利用模型肽6，首先对不同的的卤素试剂进行筛选，结果表明除了NBS，其他的碘试剂（碘、NIS、I-Cl和I-Br）都表现出很高的转化效率。之后作者对不同类型化学溶剂进行了筛选，实验证明极性非质子溶剂具有良好的转化效率。在优化完实验条件后，作者设计合成了34个不同序列的多肽分子，研究了该反应的适用范围和局限性，结果表明：1）胺基以及酚羟基需要功能团保护，醇羟基（Thr和Ser）则并不需要；2）因为位阻影响，色氨酸的吲哚环不应保护；3）柔性多肽序列往往具有较高的反应性。

图3. 碘介导的 tryptathionine桥键合成。图片来源：JACS

在对该方法进行了深入探索后，作者将目标集中在鹅膏蕈碱的全合成。首先根据碘介导的环化效率，确定大环内酰胺化的反应位点为（4,5）-二羟基-（4R，3R, 2S）-异亮氨酸（DHIle）和顺式-4-羟基脯氨酸（Hyp）之间。随后根据逆合成分析，利用不对称催化反应完成两个非天然氨基酸的合成，实现了对该分子的化学合成（图4）。在此基础上，作者设计合成了25个新颖的鹅膏毒素分子，对其构效关系（SAR）进行了全面的研究。之前的毒理学证实鹅膏蕈碱因为可以被阴离子转运蛋白（OATP1B3）转运至肝脏细胞，具有极强的肝脏毒性。为了寻找高效且低毒的前景分子，研究团队首先利用体外实验评估了目标分子对RNA聚合酶的抑制活性和细胞毒性，将正常HEK-239 和HEK-239-OATP1B3的细胞毒性实验进行比较，验证其类似物是否被OATP1B3转运。实验结果表明除7位的Gly位点可以改造，其余位点的耐受性极差。相比模板分子Ama-01（图4，6.8 nM），合成的Ama-15对RNA聚合酶的抑制活性增强了五倍（1.4 nM），但是其对人胚胎肾细胞的毒性明显减弱。

图4. 逆合成分析和构效关系。图片来源：JACS

该研究成果为快速高效合成鹅膏蕈碱类毒素，寻找新型payload用来研究偶联药物铺平了道路，为多肽环化策略提供了新的思路。相关工作已经申请了国际专利，并发表在Journal of the American Chemical Society。姚贵阳博士和博士生Caroline H. Knittel为该文共同第一作者，柏林工业大学Roderich D. Süssmuth教授为通讯作者，该工作是与柏林自由大学和Heidelberg Pharma合作完成，并得到洪堡基金会和DFG的支持。

J. Am. Chem. Soc., 2021, DOI: 10.1021/jacs.1c06565